Imobilização de pectinases em partículas de quitosana ativadas por genipina e aplicação na clarificação de sucos de frutas : estudo dos parâmetros geométricos dos biorreatores

Abstract

A clarificação enzimática de sucos já é amplamente difundida, entretanto, a imobilização de enzimas para este fim, utilizando materiais atóxicos (como a genipina), bem como a aplicação destes biocatalisadores em biorreatores para uso contínuo ainda carecem de estudos. Somado a isso, o desconhecimento da relação entre a geometria e a fluidodinâmica do biorreator, e o impacto desta na clarificação contínua de sucos, motivaram este trabalho. Neste estudo, investigou-se o potencial de esferas de quitosana ativadas com genipina como suporte para a imobilização de pectinase, e sua aplicação subsequente na clarificação de suco de frutas, especialmente na utilização desses biocatalisadores em reatores de leito fixo e o impacto da geometria do reator no processo de clarificação. A etapa inicial envolveu a ativação do suporte com genipina e a avaliação de parâmetros de imobilização, incluindo o pH de ativação do suporte, a carga enzimática e o pH de imobilização. Na sequência, estudouse a estabilidade térmica e operacional da enzima, além da clarificação contínua de sucos de frutas. Cinco reatores de leito fixo distintos foram utilizados para observar o impacto da geometria na fluidodinâmica e, consequentemente, no processo de clarificação. Para isso, os reatores foram analisados em dois diferentes grupos: reatores com mesmo volume (40 mL – A: r = 0,64 cm, L = 31,5 cm; B: r = 0,80 cm, L = 20 cm; C: r = 1,13 cm, L = 10 cm) e reatores com a mesma área da seção transversal (2 cm2 – B: V = 40 mL; D: V = 60 mL; E: V = 20 mL). Quando analisada a carga enzimática oferecida ao suporte, quantidades superiores a 100 mg de proteína /g de suporte não demonstraram aumento na atividade imobilizada, e a atividade recuperada observada foi em torno de 1 %. A enzima imobilizada apresentou estabilidade notável, retendo cerca de 60 % de sua atividade inicial após suportar 5 h a 60°C, em contraste com a rápida inativação da enzima livre em menos de 1 h. Não houve diferença estatística significativa entre a enzima livre e imobilizada em relação à eficiência de clarificação (redução da turbidez) do suco de laranja, já a eficiência de clarificação do suco de uva usando a enzima imobilizada foi estatisticamente maior do que com a enzima livre. No teste de estabilidade da atividade enzimática em batelada, a enzima imobilizada manteve 40 % de sua atividade relativa inicial ao longo de 20 ciclos, demonstrando seu potencial para uso prolongado. A clarificação de sucos de frutas, no entanto, apresentou desafios devido à adsorção de partículas do suco nos biocatalisadores, reduzindo sua atividade. Uma abordagem aprimorada de lavagem ajudou a remover as partículas adsorvidas e manteve 40 % das capacidades iniciais, mesmo após 10 ciclos. Para os reatores, avaliações do tempo de residência revelaram, nos reatores com volumes iguais, variações na capacidade de clarificação atribuídas a diferenças de geometria. Testes de estabilidade da atividade enzimática demonstraram manutenção da atividade ao longo de 100 h, no entanto, para a estabilidade da clarificação de sucos de frutas, a acumulação de partículas prejudicou a clarificação contínua de sucos dentro de sistemas de leito fixo, levando à necessidade de soluções inovadoras. Para mitigar isso, uma abordagem inovadora envolveu a alteração da orientação da bomba, redirecionando o fluxo de suco (descendente) e um período de hidrólise prolongado de 80 h, até que não houvesse mais clarificação observada. Em resumo, este estudo revelou o potencial das esferas de quitosana ativadas com genipina para a imobilização de pectinase e a clarificação de sucos de frutas. Ele enfatiza a importância do projeto do reator e a necessidade de abordar desafios como a acumulação de partículas. Os resultados destacam o valor das enzimas imobilizadas na melhoria do processamento de sucos e na otimização da estabilidade e configuração do reator para processos de clarificação bem-sucedidos e sustentáveis.

Enzymatic clarification of juices is already widely practiced. However, the immobilization of enzymes for this purpose using non-toxic materials (such as genipin), as well as the application of these biocatalysts in continuous-use bioreactors, still lack comprehensive studies. Furthermore, the lack of knowledge regarding the relationship between the geometry and fluid dynamics of the bioreactor, and its impact on the continuous clarification of juices, has motivated this research. This study investigated the potential of chitosan beads activated with genipin as a support for pectinase immobilization and their subsequent application in fruit juice clarification, particularly in the utilization of these biocatalysts in packed-bed reactors and the impact of reactor geometry on the clarification process. The initial stage involved support activation with genipin and the assessment of immobilization parameters, including support activation pH, enzyme loading, and immobilization pH. Subsequently, thermal and operational stability of the enzyme was studied, as well as continuous fruit juice clarification. Five different packed-bed reactors were employed to observe the impact of geometry on fluid dynamics and, consequently, the clarification process. For this purpose, the reactors were analyzed in two different groups: reactors with the same volume (40 mL - A: r = 0.64 cm, L = 31.5 cm; B: r = 0.80 cm, L = 20 cm; C: r = 1.13 cm, L = 10 cm) and reactors with the same cross-sectional area (2 cm2 - B: V = 40 mL; D: V = 60 mL; E: V = 20 mL). Regarding the enzyme loading on the support, quantities exceeding 100 mg of protein per gram of support did not show an increase in immobilized activity, and the observed recovered activity was approximately 1%. The immobilized enzyme exhibited remarkable stability, retaining about 60% of its initial activity after enduring 5 hours at 60°C, in contrast to the rapid inactivation of free enzyme in less than an hour. There was no statistically significant difference between free and immobilized enzyme in terms of juice clarification efficiency (reduction of turbidity) for orange juice, while the clarification efficiency of grape juice using immobilized enzyme was statistically higher than with free enzyme. In the batch stability test of enzyme activity, the immobilized enzyme maintained 40% of its initial relative activity over 20 cycles, demonstrating its potential for extended use. However, fruit juice clarification presented challenges due to the adsorption of juice particles on the biocatalysts, reducing their activity. An improved washing approach helped remove adsorbed particles and maintained 40% of initial capacities even after 10 cycles. For the reactors, residence time evaluations revealed variations in clarification capacity attributed to geometric differences in reactors with equal volumes. Stability tests of enzyme activity demonstrated maintenance of activity over 100 hours; however, for the stability of fruit juice clarification, particle accumulation hindered continuous juice clarification within fixed-bed systems, necessitating innovative solutions. To mitigate this issue, an innovative approach involved altering the pump orientation, redirecting the juice flow (downward) and an extended hydrolysis period of 80 hours until no further clarification was observed. In summary, this study revealed the potential of genipin-activated chitosan beads for pectinase immobilization and fruit juice clarification. It underscores the importance of reactor design and the need to address challenges such as particle accumulation. The results highlight the value of immobilized enzymes in improving juice processing and optimizing reactor stability and configuration for successful and sustainable clarification processes.