Caracterização do sistema purinérgico e seu envolvimento na progressão de meduloblastomas

Abstract

Meduloblastoma é um tipo de tumor neuroepitelial que acomete principalmente o cerebelo de crianças com idade média de aproximadamente nove anos. Estes tumores são identificados como a principal malignidade cerebral entre crianças e são classificados pela Organização Mundial de Saúde como tumores de alto grau. Inúmeras alterações gênicas, cromossômicas e em vias de sinalização têm sido utilizadas como ferramentas para a classificação de tumores. Alterações evidenciadas no sistema purinérgico, o qual se baseia no estudo das funções desencadeadas pelo ATP e outros nucleotídeos e nucleosídeos no meio extracelular têm sido identificadas por favorecerem a progressão de malignidades. Tais funções são mediadas pela ativação de um amplo grupo de receptores purinérgicos denominados P2, e reguladas por uma família de enzimas denominadas ectonucleotidases. Nosso grupo de pesquisa tem publicado resultados que apontam para a íntima relação entre o sistema purinérgico e a progressão de gliomas. No intuito de dar contunuidade a estes estudos em outros tumores do sistema nervoso central, o objetivo principal desta tese de doutorado foi caracterizar a expressão e funcionalidade do sistema purinérgico em diferentes linhagens de meduloblastoma humano fazendo uso de técnicas tanto in vitro quanto in vivo. Observamos que as linhagens Daoy, ONS76 e D283 apresntaram a expressão e funcionalidade dos receptores purinérgicos P2 de forma bastante significativa. Dentre os receptores expressos, enfatizamos os estudos sobre o P2X₇ o qual, quando estimulado por concentrações farmacológicas de ATP desencadeou morte celular na linhagem Daoy de MB humano, confirmando o potencial deste receptor como um eficiente alvo de terapias contra esse tipo de câncer. Na sequencia, avaliamos a família das ectonucleotidases, onde observamos que assim como em gliomas, os meduloblastomas apresentam uma baixa capacidade de hidrólise do ATP no meio extracelular e uma alta atividade AMPásica, atribuída a elevada expressão de enzima ecto-5'NT/CD73 pelas linhagens Daoy e ONS76. Já a linhagem D283 apresentou ausência da atividade e expressão desta enzima. Sabendo que a ecto-5'NT/CD73 tem sido descrita por favorecer a progressão de tumores, superexpressamos essa enzima na linhagem D283 e avaliamos o crescimento dos tumores formados após o implante in vivo. Observamos que, para os meduloblastomas, a presença da enzima promoveu uma significativa redução no tamanho dos tumores implantados quando comparado com o grupo controle. Esses resultados nos levam a sugerir que a expressão da ecto-5'NT/CD73 por células de meduloblastoma pode ser considerada um marcador de prognóstico assim como ser utilizada como um possível alvo terapêutico no tratamento desta malignidade. Por fim, de uma forma geral, mostramos o funcionamento do sistema purinérgico em mais um tipo de tumor e que a sua modulação pode servir, de diferentes formas, como ferramenta para o controle da progressão de meduloblastomas.

Medulloblastoma is a kind of neuroepithelial tumor that mainly affects the cerebellum of children with median age of nine years old. These tumor are identified as the principal brains malignancy in children and are classified by the World Health Organization as tumors of high malignancy. Numerous genetic mutations as well chromosomal and signaling pathways alterations have been used as tools to classify these tumors. Changes in the purinergic system, wich is based on the study of functions triggering by ATP and others nucleotides and nucleosides into the extracellular medium, have been described to favoring the malignancies progression. These functions are mediated by stimulation of a broad group of purinergic receptors named P2 and regulated by enzimes family called ectonucleotidases. Our research group has published results that indicate the relationship between the purinergic system and the glioma progression. In view of the continuation of these studies in other tumors of the central nervous system, the main objective of this thesis was to characterize the expression and function of the purinergic system in different human medulloblastoma cell lines making use of in vitro and in vivo techniques. We observe that Daoy, ONS76 and D283 showed the pronounced expression and function of P2 purinergic receptors. Among the expressed receptors we highlight the studies about the P2X₇. When stimulated by pharmacological ATP concentrations it triggered cell death in Daoy cell line, confirming the potencial of this receptor as a target for effective cancer therapies. Considering the necessity for the modulation of this system, we avaluated at the sequence the ectonucleotidases family. We observed that the medulloblastoma cell lines presented reduced ATP hydrolysis in the extracellular medium and presented a prominent AMP hydrolysis wich was attributed to ecto-5'NT/CD73 expression presented by Daoy and ONS76 cell lines. D283 cell line did not shown expression or activity attributed to this enzyme. Knowing that ecto-5'NT/CD73 has been described to favor the tumor progression, we performed the overexpression of this enzyme in the D283 cell line and its functionality was evaluated in an in vivo xenograph tumor model. The overexpression of this enzyme caused a significant reduction in the implanted tumors growth when compared to the control group. These results lead us to suggest that the expression of ecto-5'NT/CD73 by medulloblastoma might be considered as a prognostic marker and can be planned to be used as a therapeutic target in the treatment to this malignancy. Overall, we show the purinergic system functionality in the another type of tumor and that its modulation might be suggested as a tool to control of medulloblastoma progression.