Associação entre hipotermia terapêutica e memantina como estratégia neuroprotetora para o tratamento da hipóxia-isquemia encefálica neonatal

Abstract

A superestimulação dos receptores N-metil-D-aspartato (NMDA) causada pela excitoxicidade glutamatérgica pode ativar vias de morte celular. Este é um dos eventos relevantes na hipóxia-isquemia (HI) neonatal, cujo tratamento padrão é a hipotermia terapêutica (HT). No entanto, a HT é recomendada para lesões cerebrais de grau moderado a grave e crianças que apresentam HI de grau leve não são tratadas devido ao risco de resultados adversos. Apesar disso, esses recémnascidos com lesão leve podem apresentar significativos sinais de lesão cerebral em períodos mais tardios do seu desenvolvimento. Investigamos os potenciais efeitos neuroprotetores do tratamento com memantina (um antagonista NMDA nãocompetitivo) combinado com a HT em ratos neonatos machos e fêmeas submetidos à HI com a produção de lesão cerebral leve-moderada. Foram utilizados filhotes de 7 dias (P7) submetidos à oclusão da artéria carótida comum direita seguida de 90 min de hipóxia (8% O2). Os animais do grupo SHAM foram submetidos a uma cirurgia fictícia. A memantina foi administrada (i.p., 20 mg/kg) imediatamente após a hipóxia. Após um período de recuperação, os filhotes foram expostos à HT (32°C por 5 h). Os filhotes foram pesados de P6 a P9 e submetidos aos testes comportamentais de geotaxia negativa e reflexo de endireitamento. Os animais foram eutanasiados em P9. Foi realizada a análise do volume de lesão encefálica pela coloração de cloreto de trifeniltetrazólio (TTC). O hipocampo ipsilateral à lesão foi coletado e a expressão de p-Akt, caspase-3 clivada e Bcl-XL foram avaliadas por Western blotting. Nos machos, o tratamento com hipotermia foi capaz de reverter a lesão causada pela HI. Já nas fêmeas, tanto o grupo HT quanto o grupo com os tratamentos combinados tiveram uma piora na lesão; entretanto, o grupo tratado apenas com memantina sugere uma neuroproteção, não mostrando diferença do grupo SHAM. Em análises moleculares, nas fêmeas, o tratamento combinado reduziu a expressão da caspase3 clivada em 47% (p<0,05, ANOVA) em relação aos animais do grupo HI. No entanto, não foram observadas diferenças significativas na expressão de p-Akt e Bcl-XL, e as fêmeas de todos os grupos tiveram ganho de peso semelhante. Nos machos, não houve diferença significativa na expressão hipocampal de p-Akt, caspase-3 clivada, ou Bcl-XL. Estes resultados sugerem que a terapia combinada é capaz de regular negativamente a expressão de caspase-3 clivada, prevenindo a apoptose no hipocampo de fêmeas com lesão hipóxico-isquêmica leve. Assim, a combinação de memantina e HT pode ser uma terapia promissora para o tratamento da hipóxia-isquemia neonatal de grau leve, pelo menos em ratas. Contudo, mais pesquisas são necessárias para abordar se a memantina e a hipotermia combinada devem ser utilizadas como estratégia neuroprotetora para HI leve.

Overstimulation of N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors caused by glutamatergic excitoxicity can activate cell death pathways. This is a relevant event in neonatal hypoxia-ischemia (HI), whose standard treatment is therapeutic hypothermia (HT). However, HT is recommended for the treatment of moderate to severe brain injury; children with mild HI brain lesion are not treated due to the risk of adverse outcomes. Despite this, these infants with mild lesion may show signs of more significant brain damage later in life. We investigated the potential neuroprotective effects of treatment with memantine (a non-competitive NMDA antagonist) combined with HT in male and female neonatal rats undergoing HI (mild-moderate brain lesion). Sevenday-old pups (P7) were submitted to occlusion of the right common carotid artery followed by 90 min of hypoxia (8% O2). Animals from the SHAM group underwent fictitious surgery. Memantine was administered (i.p., 20 mg/kg) immediately after hypoxia. After a recovery period, pups were exposed to HT (32°C for 5 h). Pups were weighed from P6 to P9 and submitted to the behavioral tests of negative geotaxis and righting reflex; animals were euthanized at P9. The volume of brain lesion was evaluated in brain slices stained with triphenyltetrazolium chloride (TTC). The hippocampus ipsilateral to the lesion was collected and the expression of p-Akt, cleaved caspase-3 and Bcl-XL were evaluated by Western blotting. In males, treatment with hypothermia was able to reverse the injury caused by HI in the TH group. In females, both the HT group and the group with combined treatments had a worsening of the lesion; however, the group treated with memantine suggests neuroprotection, not showing any difference from the SHAM group. In molecular analyses, the combined treatment reduced the expression of cleaved caspase-3 by 47% (p<0.05, ANOVA) in females, compared to animals of the HI group. However, no significant differences were observed in p-Akt and Bcl-XL expression, and females from all groups had similar weight gain. In males, there was no significant difference in hippocampal expression of p-Akt, cleaved caspase-3, or Bcl-XL. These results suggest that combined therapy is able to down-regulate cleaved caspase-3, preventing apoptosis in the hippocampus of females with mild HI brain injury. Thus, the combination of memantine and HT may be a promising therapy for the treatment of mild neonatal hypoxia-ischemia, at least in female rats. However, more research is needed to address whether memantine and combined hypothermia should be used as a neuroprotective strategy for mild HI.