Lysobacter sp. A03 : uma abordagem genômica e funcional para a busca de peptidases ativas em baixas temperaturas

Abstract

Peptidases são responsáveis pela hidrólise de ligações peptídicas em cadeias polipeptídicas e, além do seu papel vital em todos os organismos vivos, possuem uma longa história de utilização pela humanidade, principalmente no processamento de alimentos. Estima-se que o mercado global de enzimas chegue a US$7,1 bilhões em 2018, dos quais 60% correspondem ao comércio de peptidases. Porém, a maioria das peptidases disponíveis foi isolada de organismos mesofílicos e termofílicos. As enzimas psicrofílicas são uma alternativa valiosa, pois são ativas em baixas temperaturas, reduzindo os custos energéticos da sua utilização e são facilmente inativadas, sendo úteis em reações que necessitam de condições amenas. Com o objetivo de buscar por peptidases com atividade queratinolítica em baixas temperaturas, linhagens bacterianas antárticas foram isoladas e, de acordo com a sua habilidade de degradar resíduos queratinosos, três foram selecionadas e tiveram seus parâmetros bioquímicos avaliados. Considerando sua maior atividade queratinolítica, a bactéria Lysobacter sp. A03 foi escolhida para ter o seu genoma sequenciado e para a construção de uma biblioteca genômica a fim de isolar peptidases com potencial industrial e biotecnológico. Através dessa estratégia, uma serino-endopeptidase, denominada A03Pep1, foi encontrada, sendo funcional e estruturalmente caracterizada. Seu precursor, de 72,5 kDa, foi composto por 5 domínios que, através do auto-processamento, originam a forma madura da enzima, estimada em 35 kDa. A expressão heteróloga foi realizada no vetor pGEX-4T-2 e a peptidase A03Pep1 recombinante foi recuperada principalmente no sobrenadante dos cultivos da hospedeira E. coli ArticExpress. A atividade ótima da peptidase ocorreu em pH 9,0 e 40°C, sendo acentuada na presença de Ca2+ até a concentração de 25 mM e na presença de 10 mM de Na2+, NH4+, Mg2+ e Ba2+ , e foi inibida por 10mM de Zn2+. Através da modelagem 3D, foi predito um sítio de ligação ao substrato mais amplo na peptidase A03Pep1 quando comparada à sua homóloga mesofílica AprV2, provavelmente devido ao encurtamento de uma alça situada próxima ao sítio ativo da enzima, presumivelmente como uma forma de aumentar a probabilidade de ligação ao substrato em baixas temperaturas. Através da discussão das características funcionais e estruturais da peptidase psicrofílica A03Pep1, os resultados possibilitam abordagens para o desenvolvimento de enzimas biotecnologicamente relevantes ativas em temperaturas baixas e moderadas.

Peptidases are responsible for the hydrolysis of peptide bonds in a polypeptide chain and in addition to their critical roles in all living organisms, they have a long history of use by the humankind, mainly in the processing of food. The global enzymes market was estimated to be worth US$7.1 billion in 2018, of which the peptidases account for approximately 60%. However, the majority of the commercially available peptidases were isolated from thermophilic and mesophilic organisms. Psychrophilic enzymes are a valuable alternative as they are active at low temperatures, reducing the energy costs of its utilization and as they can be easily inactivated, being useful in reactions that have to be performed under mild conditions. Aiming to search for peptidases with keratinolytic activity under low temperatures, Antarctic bacterial strains were isolated and based on its ability of degrading keratinous waste, three of them were chosen and had their biochemical parameters evaluated. Considering its higher keratinase activity, the bacterium Lysobacter sp. A03 was selected to have its genome sequenced and for the construction of a genomic library to search for keratinolytic peptidases with biotechnological and industrial potential. Through this strategy, one serine-endopeptidase, called A03Pep1, was found and structurally and functionally characterized. Its precursor, of 72.5 kDa, was composed by five domains that, by means of autoprocessing, originate the mature enzyme, estimated in 35 kDa. The heterologous expression was performed in pGEX-4T-2 vector and the recombinant peptidase A03Pep1 was recovered mainly in the supernatants of E. coli ArcticExpress cells cultures. The optimal activity of the enzyme was at pH 9.0 and 40°C and was enhanced in the presence of Ca2+ until 25 mM and in the presence of 10 mM Na2+, NH4+, Mg2+ and Ba2+ and was inhibited by 10mM of Zn2+. Based on the 3D structure modelling, was predicted a wider substrate binding site in A03Pep1 when compared with its mesophilic homologous AprV2, probably due to the shortening of a loop region located next to the active site of the enzyme, presumably as a way to enhance the probability of binding of substrates at low temperatures. By discussing the functional and structural characteristics found in the psychrophilic peptidase A03Pep1, the results provide possible approaches in developing new biotechnologically relevant enzymes active under low to moderate temperatures.