Alterações ósseas e edição gênica intra-articular com o sistema CRISPR/Cas9 no modelo murino da mucopolissacaridose tipo I

Abstract

A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é causada pela deficiência da atividade da enzima alfa-L-iduronidase (IDUA), uma enzima lisossomal responsável pela degradação dos glicosaminoglicanos (GAGs) dermatan sulfato (DS) e heparan sulfato (HS). GAGs são importantes componentes da matriz extracelular. O acúmulo de GAGS progride ao longo da vida e causa manifestações clínicas altamente variáveis, incluindo comprometimento ósseo e articular, que causam um grande impacto na saúde e qualidade de vida dos pacientes. A fisiopatologia osteoarticular da MPS I ainda não é totalmente compreendida. Adicionalmente, os ossos e articulações são regiões de difícil acesso para fornecimento dos produtos terapêuticos atualmente disponíveis para MPS I, a terapia de reposição enzimática (TRE) e o transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH). Assim, o objetivo deste trabalho foi, a partir de um modelo murino de MPS I, elucidar as alterações presentes no tecido ósseo e desenvolver um protocolo de edição gênica com o sistema CRISPR/Cas9, como terapia in situ, buscando corrigir as alterações articulares. Demonstramos informações importantes sobre características morfológicas e biomecânicas ósseas que são diferentes entre os camundongos selvagens e MPS I, aos 6 meses de idade. Avaliamos se a edição gênica com o sistema CRISPR/Cas9 intravenoso e os tratamentos farmacológicos com inibidor de catepsina B, losartana ou propranolol, que anteriormente apresentaram efeitos promissores e relevantes em tecidos de difícil acesso, como aorta, válvulas cardíacas e ossos, eram capazes de melhorar características morfológicas e biomecânicas do tecido ósseo. Demonstramos que esses tratamentos não foram capazes de normalizar completamente as alterações ósseas presentes no modelo animal. Comprovamos que os lipossomas catiônicos carregando plasmídeos com o sistema CRISPR-Cas9 aplicado por via intra-articular levaram a um aumento localizado na atividade da IDUA e redução no acúmulo de GAGS nesse tecido. A partir dos resultados gerais, pudemos constatar que existem parâmetros que podem ser mensurados para avaliar alterações ósseas na MPS I, e que podem ser usados para testar futuras abordagens terapêuticas. Além disso, a edição gênica intra-articular, utilizando vetores não virais para a entrega do sistema CRISPR-Cas9, pode ser utilizada como alternativa para tratar os problemas articulares da MPS I, bem como outras doenças articulares.

Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is caused by a deficiency in the activity of the enzyme alpha-L-iduronidase (IDUA), a lysosomal enzyme responsible for the degradation of glycosaminoglycans (GAGs) dermatan sulfate (DS) and heparan sulfate (HS). GAGs are important components of the extracellular matrix. The accumulation of GAGs progresses throughout life and causes highly variable clinical manifestations, including bone and joint involvement, which have a major impact on patients' health and quality of life. The osteoarticular pathophysiology of MPS I is still not fully understood. Additionally, the bones and joints are regions of difficult access to therapeutic products currently available for MPS I, such as enzyme replacement therapy (ERT) and hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). Thus, the objective of this work was to elucidate the alterations present in the bone tissue in MPS I mice and to develop a gene editing protocol with the CRISPR/Cas9 system, as an in-situ therapy, seeking to correct the joint alterations. We demonstrated important information regarding morphological and biomechanical characteristics of MPS I bones, that are different between wild-type and MPS I mice at 6 months of age. We also evaluated whether gene editing with intravenous CRISPR/Cas9 system and pharmacological treatments with cathepsin B inhibitor, losartan, or propranolol, which previously showed promising and relevant effects in difficult-to-access tissues, such as aorta, heart valves and bones, were able to improve morphological and biomechanical characteristics of bone tissue. We showed that none of these treatments were able to completely normalize the bone changes present in the animal model. We proved that intra-articular administration of cationic liposomes carrying plasmids with the CRISPR-Cas9 system led to a localized increase in IDUA activity and a reduction in the accumulation of GAGS in this tissue. From these results, we could observe that there are parameters that can be measured to assess bone changes in MPS I, and that can be used to test future therapeutic approaches. In addition, intra-articular gene editing, using non-viral vectors for the delivery of the CRISPR-Cas9 system, can be used as an alternative to treat the joint problems of MPS I, as well as other joint diseases.