Investigação de grandes rearranjos e mecanismo de doença nas genodermatoses mais comuns: Neurofibromatose tipo 1 e Esclerose tuberosa

Abstract

Introdução: As doenças monogênicas neurofibromatose tipo 1 (NF1) e esclerose Tuberosa (ET) são consideradas síndromes genéticas raras com malignidade associada. Trata-se das duas genodermatoses mais frequentes, que apresentam como sintomas em comum as lesões cutâneas, ocorrência de tumores no Sistema Nervoso Central, deficiência cognitiva e/ou de desenvolvimento. Com uma gama variada de alterações genéticas envolvidas e sintomas em diferentes graus de comprometimento, caracterizar essas doenças, bem como investigar as alterações genéticas encontradas em subgrupos clínicos é um desafio. Objetivos: O objetivo dos trabalhos reunidos nesta tese foi caracterizar, do ponto de vista evolutivo, clínico e molecular, pacientes com NF1 e ET diagnosticados com rearranjos gênicos, realizar caracterização molecular adicional por análise de transcritos em pacientes com diagnóstico clínico de ET, bem como explorar o mecanismo de autofagia envolvido nesta doença. Resultados: Através de uma abordagem evolutiva foram avaliadas microdeleções encontradas em pacientes com NF1 envolvendo quatorze genes co-deletados. Destes, dez genes mostraram seleção purificadora e quatro genes mostraram seleção positiva, sendo um deles, RNF135, apresentando também seleção positiva de aminoácidos específicos, reforçando sua importância e contribuição para a doença e possível correlação da sua deleção com o fenótipo mais grave desses pacientes. Adicionalmente, foi apresentado relato de caso de um paciente com ET e rearranjo gênico, descrevendo manifestações clínicas não habitualmente relacionadas com a doença e sugerindo, através de revisão de todas as evidências existentes, a inclusão destas manifestações no fenótipo da síndrome. Como resultados preliminares, apresentamos o recrutamento de pacientes com ET e variantes de significado incerto ou ausência de variante patogênica na região codificadora dos genes TSC1 e TSC2, bem como o desenho de primers que serão utilizados para a investigação de exon-skipping no RNA mensageiro desses pacientes. Por fim, uma revisão bibliográfica apresenta o paradoxo da via de autofagia e potenciais estratégias terapêuticas envolvidas com essa via para pacientes acometidos com ET e resultados preliminares apresentam o estabelecimento de fibroblastos de paciente ET com mutação em TSC2 e de fibroblastos de indivíduo sem ET, a fim de realizar avaliação do impacto de moduladores de autofagia no fluxo autofágico e nos mecanismos de mitofagia, apoptose e necrose celular.

Introduction: Neurofibromatosis type 1 (NF1) and tuberous sclerosis complex (TSC) are the most common genodermatoses. They are monogenic, autosomal dominant disorders associated with skin abnormalities, increased risk for developing certain tumors, mainly of the peripheral and central nervous system, cognitive and/or developmental disabilities and other findings. The disorders are characterized by complete penetrance but variable expressivity and significant molecular heterogeneity, which result in challenges in terms of the clinical and molecular diagnosis of the affected patients. Objectives: The main goal of this thesis was to characterize, from an evolutionary, clinical, and molecular point of view, patients with NF1 and TSC diagnosed with gene rearrangements, perform additional molecular investigations in patients with the clinical diagnosis of ET, as well as exploring the autophagy mechanism involved in this disease. Results: Through an evolutionary approach, microdeletions identified in NF1 patients and involving fourteen co-deleted genes were characterized. Of these, 10 genes showed purifying selection and 4 genes showed positive selection, with one of them, RNF135, also presenting positive selection of specific amino acids. These findings related to RNF135 suggest its importance and contribution to the disease and a possible correlation of its deletion with a more severe phenotype in affected patients. Additionally, a case report of a patient with TSC and a gene rearrangement is presented. It describes clinical manifestations not usually observed in TSC and suggests, through a review of all the existing evidence, the inclusion of these manifestations in the syndrome’s phenotype. In addition, the thesis contains preliminary results of the additional molecular investigation, focused on mRNA/exon skipping analyses, of TSC patients with variants of uncertain significance (VUS) or absence of pathogenic variants in the coding region of the TSC1 or TSC2 genes. Finally, a comprehensive review on the paradox of autophagy in TS and of potential novel therapeutic strategies related to autophagy for TS patients is presented as well as preliminary results on an investigation of autophagy modulators in fibroblast of TSC patients. Discussion and conclusions: NF1 and TSC are well characterized genodermatoses from a 13 clinical and molecular point of view. However, there are still important gaps about these syndromes, such as an incomplete understanding of genotype-phenotype relationships (especially related to gene rearrangements), absence of a specific disease-causing molecular lesion in some patients, and uncertainties related to the exact mechanisms that lead to these disorders and their complications. This thesis aims to contribute to the understanding of some of these aspects, ultimately leading to improved diagnosis and management of patients and their family members, with impacts both on genetic counseling and on development of potential novel therapeutic interventions. Discussão e conclusões: A NF1 e a ET são genodermatoses bem caracterizadas do ponto de vista clínico e molecular. No entanto, ainda existem lacunas importantes acerca destas síndromes, como o entendimento completo de relações genótipo-fenótipo (em especial de rearranjos gênicos), da ausência de identificação da lesão molecular em todos os casos com diagnóstico clínico, e dos mecanismos relacionados à patogênese destas doenças. Essa tese foi desenvolvida para contribuir no entendimento de alguns destes aspectos. Esforços voltados para uma melhor compreensão destas lacunas poderão resultar na inclusão dos achados desta tese no diagnóstico molecular dessas doenças e no aprimoramento do manejo dos pacientes e familiares, com impactos tanto no aconselhamento genético quanto para desenvolvimento de potenciais alternativas terapêuticas.