Estruturação genômica e padrão de expressão das proteínas híbridas ricas em prolina (HyPRPs) em soja (Glycine max (L.) Merrill)

Abstract

Os estresses abióticos, tais como seca, alta salinidade e temperaturas extremas são as causas primárias de quebras de safra na agricultura mundial, reduzindo a produção das principais culturas em mais de 50%. Dentre os estresses citados, a seca é um dos principais responsáveis pelas perdas na produção, mesmo que as plantas, ao longo da evolução, já tenham desenvolvido complexas vias metabólicas de resistência à falta de água. As funções classicamente conhecidas da parede celular são: estruturação da planta, determinação do tamanho e do formato das células vegetais e atuação como barreira mecânica à invasão de patógenos. Além disso, vários genes que codificam proteínas da parede celular têm sua regulação alterada mediante alta salinidade, seca e baixas temperaturas, indicando sua participação na resposta ao estresse hídrico. As Proteínas Híbridas Ricas em Prolina (HyPRPs) são glicoproteínas de parede celular com função pouco conhecida. O gene SbPRP (Glyma14g14220), membro da família HyPRP de soja, teve sua expressão aumentada perante a seca, ao estresse salino, a hormônios vegetais, ao ácido salicílico e a infecções virais em um trabalho onde foi utilizada a técnica de Northern blot. Com o objetivo de entender a atuação da proteína SbPRP na aclimatação da soja para tolerância à seca, a região codificadora do gene SbPRP foi isolada por PCR a partir do DNA total de Glycine max (cultivar IAS5), utilizando-se iniciadores específicos. Através do sistema Gateway-Invitrogen de clonagem por recombinação foram obtidas construções para superexpressão e silenciamento de SbPRP. Conjuntos embriogênicos somáticos das cultivares IAS5 e Vencedora foram submetidos ao protocolo de transformação, que combina bombardeamento com o sistema Agrobacterium e ao protocolo de biolística. Atualmente, embriões histodiferenciados encontram-se na fase de regeneração, já tendo sido obtidas cinco plântulas trifolioladas relativas à construção de superexpressão. Com o sequenciamento do genoma da soja foi possível a identificação de 35 genes HyPRP. Através de análises filogenéticas, envolvendo os 35 membros HyPRP de soja, o gene SbPRP (Glyma14g14220) ficou agrupado no mesmo clado composto por outros três genes HyPRP (Glyma04g06970, Glyma06g07070 e Glyma17g32100). Na tentativa de aumentar o conhecimento do papel biológico das HyPRPs em soja, foram delineados experimentos para verificação da resposta dos quatro genes do clado monofilético (Glyma04g06970, Glyma06g07070, Glyma17g32100 e Glyma14g14220). Transcritos do gene Glyma06g07070 não puderam ser detectados, sendo excluídos das análises. Foi possível avaliar os transcritos de três destes genes por PCR em Tempo Real, a partir de RNA de plantas de soja submetidas a tratamentos de alta salinidade, ácido abscísico (ABA), ácido salicílico e infecção por Phakopsora pachirizi (fungo causador da ferrugem asiática). Foram constatados aumentos significativos na expressão dos genes em diversos tempos após a inoculação de urediniósporos de P. pachirizi, em resposta a tratamento com ABA e em resposta ao ácido salicílico. O tratamento com sal reprimiu a expressão dos genes Glyma14g14220 e Glyma17g32100. Os resultados obtidos reforçam a possibilidade das HyPRPs estarem envolvidas em resposta a estresses bióticos e abióticos.

Abiotic stresses like drought, high salinity and high temperatures are the main causes of yield losses in agriculture, causing production decreases of more than 50% in the major crops around the world. Among the cited stresses, drought figures as one of the most important agents causing production decrease, even though plants have developed complex metabolic pathways to tolerate water deficit along evolution. The traditional cell wall functions known are: plant structure, cell format and size determination, and a role as mechanical barrier against pathogen attacks. Besides that, many genes encoding cell wall proteins have their regulation modified by high salinity, drought and low temperatures, which indicates a participation in response to water stress. The Hybrid Proline Rich Proteins (HyPRPs) are cell wall glycoproteins with poorly known function. The gene SbPRP (Glyma14g14220), a HyPRP soybean member, has its expression increased under drought conditions, high salinity, treatment with hormones, salicylic acid and viral infections. Aiming to understand the role of the SpPRP protein in the soybean drought tolerance acclimatation, the SbPRP gene coding sequence was isolated by PCR cloning using specific primers and Glycine max (cultivar IAS5) genomic DNA as template. Constructions were obtained through the Gateway system for SbPRP super expression and silencing. Somatic embryogenic (IAS5 and Vencedora soybean cultivars) sets were submitted to the combined Agrobacterium/bombardment or biolistic protocols. Histo-differentiated embryos are presently in the regeneration phase, and five tree-leaf-seedlings containing the super expression construction were already obtained. After the soybean genome sequencing, it was possible to identify 35 HyPRP genes. Based on phylogenetic analysis, the SbPRP gene has grouped in the same clade formed by three other HyPRP genes (Glyma04g06970, Glyma06g07070 and Glyma17g32100). Trying to increase the knowledge about a possible biological role of the soybean HyPRPs, experiments were delineated to check the response of the four monophyletic clade forming genes (Glyma04g06970, Glyma17g32100 and Glyma14g14220). Transcripts of three genes were detected and analyzed with Real Time PCR experiments after high salinity, ABA, and salicylic acid treatments, and Phakopsora pachirizi infection (Asian rust agent). Transcripts of the gene Glyma06g07070 were not detected in any experiment. An increase in the genes’ expression was observed after different treatment times after the P. pachirizi urediniospores inoculation, and in response to ABA and salicylic acid treatments. Salt treatment repressed the expression of Glyma14g14220 and Glyma17g32100. The results reinforce the possibility of HyPRP involvement in biotic and abiotic responses.