Produção de saponinas triterpênicas bioativas em cultivos celulares de Quillaja brasiliensis

Abstract

Quillaja brasiliensis é uma espécie arbórea conhecida popularmente como pau-sabão, que produz saponinas triterpênicas em suas folhas. As saponinas de Q. brasiliensis apresentam pronunciada atividade adjuvante em vacinas veterinárias experimentais, de forma comparável ao produto comercial Quil-A®, obtido de cascas de Quillaja saponaria. Adjuvantes são adicionados às vacinas inativadas para aumentar a potência e duração da resposta imune, garantindo a segurança e eficiência dessas formulações. Tendo em vista a possibilidade da utilização de Q. brasiliensis para a obtenção de saponinas com potencial uso comercial e considerando a necessidade de maior conhecimento sobre a produção e acúmulo sustentável de metabólitos ativos em geral, esta tese visou definir procedimentos para estabelecer culturas celulares de Q. brasiliensis e avaliar sua competência e viabilidade para produção de saponinas. Extensa análise da literatura de metabolismo especializado de plantas resultou em dois artigos de revisão, um voltado a saponinas imunoadjuvantes de Quillaja sp. e outro, à biotecnologia e biossíntese de saponinas triterpênicas. Cultivos celulares foram estabelecidos, sendo que o ciclo de cultivo de suspensões celulares foi definido como sendo de 21 dias. A produção de saponinas acompanhou o acúmulo da massa seca celular, e conteúdo máximo de saponinas coincide com o final da fase exponencial de crescimento. A caracterização química inicial das saponinas produzidas por suspensões celulares foi obtida. Sete compostos foram tentativamente identificados por LC-MS, e os padrões de fragmentação indicam que ácido quiláico foi a principal aglicona presente. As saponinas purificadas de suspensões celulares foram testadas em um ensaio com vacinas adjuvantadas contra o vírus da gripe. Houve um aumento de anticorpos em indivíduos vacinados com vacinas adjuvantadas com extratos celulares, principalmente IgG total e IgG2, contudo em um nível menor que as formulações adjuvantadas com compostos purificados de folhas de Q. brasiliensis. Além disso, protocolos de quantificação de saponinas e esteróis por GC-MS foram desenvolvidos. Estes protocolos irão subsidiar estudos de fluxo metabólico e avaliação do investimento de carbono nos pools desses compostos em suspensões celulares. Em suma, cultivos celulares de Q. brasiliensis constituem uma fonte de saponinas bioativas e representam uma excelente plataforma para o estudo da biossíntese destes produtos naturais.

Quillaja brasiliensis is a tree species popularly known as soap-tree, which produces triterpenoid saponins in its leaves. Saponins purified from leaves of Q. brasiliensis show pronounced adjuvant activity in experimental veterinary vaccines, comparable to the commercial product Quil-A®. Quil-A is purified from barks and woods of Quillaja saponaria. Adjuvants are added to inactivated vaccines to increase potency and extent of the immune response, ensuring safety, and increasing formulation efficacy. Considering the possible use of Q. brasiliensis for production of bioactive saponins and considering the need for advancing the knowledge about the sustainable supply of active metabolites in general, this thesis aimed at defining procedures to establish cell cultures of Q. brasiliensis as a potential source of saponins. Extensive analyses of the literature on plant specialized metabolism resulted in two review articles, one examining immunoadjuvant saponins of Quillaja sp. and the other focusing on plant triterpene saponin biotechnology and biosynthesis. Q. brasiliensis cell cultures were successfully established. Cell suspension culture cycle lasted 21 days, and the production of saponins followed the accumulation of cell dry mass. Chemical characterization of saponins produced by cell suspensions showed seven compounds tentatively identified by LC-MS. Fragmentation patterns indicated quillaic acid as the main aglycone present in cell extracts. Saponins purified from cell suspensions were tested in an assay for adjuvant activity, using formulations against the influenza virus. There was an increase in antibodies in groups that received vaccines prepared with cell extracts, mainly total IgG and IgG2, even though to a lesser extent than those seen for formulations that received saponins fractions purified from leaves of Q. brasiliensis. In addition, protocols for quantification of saponins and sterols by GC-MS were developed. These methods will allow studies of metabolic flux analyses and the evaluation of carbon investment in the pools of these compounds in cell suspensions. To sum up, Q. brasiliensis cell cultures constitute a source of bioactive saponins and can provide a platform for the study of the biosynthesis of these natural products.