Promoter-specific expression of the imprinted IGF2 gene in bovine oocytes and preimplantation embryos

Abstract

O splicing de precursores de RNA mensageiro para mRNA maduro é um componente crítico da regulação gênica. O processo pode codificar proteínas distintas ou afetar a estabilidade, localização e tradução de mRNAs. Já foram descritas diversas correlações entre uma maior mortalidade embrionária precoce, principalmente em embriões de produzidos in vitro (PIV), que apresentavam retardo de crescimento do concepto e expressões reduzidas de IGF2 com anormalidades placentárias e fetais durante a fase fetal. O locus IGF2 é uma região genômica complexa que produz múltiplos transcritos com splicing alternativos, a partir de vários exons distintos controlados por quatro promotores diferentes. O presente estudo explorou a expressão dos diferentes promotores do IGF2 em oócitos bovinos e embriões bovinos em estádios de pré-implantação, no intuito de esclarecer alguns aspectos da fisiologia do desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro (PIV). Para descrever o comportamento do gene IGF2, estruturas de PIV em vários estádios de desenvolvimento, desde oócitos imaturos até blastocistos expandidos, foram produzidas e coletadas em três rotinas, em pools de cinco estruturas por estádio. O RNA total foi extraído dos pools e submetido à transcrição reversa para a obtenção de cDNA, o qual foi utilizado para estimar a abundância das quatro isoformas de mRNA para o IGF2 por PCR quantitativo em tempo real (qPCR), utilizando inicializadores específicos para cada promotor do gene IGF2. Os produtos de amplificação foram submetidas ao sequenciamento de DNA para confirmação molecular. Os dados de expressão quantitativa das isoformas do IGF2 foram transformados em log para a normalização, foram analisados pelo Mixed Procedure do SAS, com comparações pareadas por LSM, para P<0,05. A expressão dirigida pelos promotores P2 e P4 seguiram o padrão observado no mRNA ativo do gene IGF2. Um pico inicial pôde ser visto em estádios precoces, entre oócitos maturados e o estádio embrionário de 2-células, principalmente causada por uma expressão materna e acumulação de transcritos antes da fecundação, seguido por uma diminuição da quantidade de transcritos até a ativação do genoma embrionário, no estádio embrionário de 8-células. Então, um novo aumento dos transcritos pôde ser detectado na compactação e cavitação embrionária. A expressão dirigida pelo promotor P1 do IGF2 mostrou-se menos representativo nas fases iniciais, havendo aumento durante a compactação, após a ativação genômica, prévia à cavitação. Diferentemente, a atividade do promotor P3 não foi detectada em embriões, estando possivelmente presente apenas em estádios mais avançados de desenvolvimento. Futuros estudos genéticos focados no desenvolvimento embrionário inicial devem prestar especial atenção ao papel da expressão do promotor P4 do gene IGF2, com os promotores P1 e P2 tendo um aparente papel secundário no desenvolvimento inicial, enquanto o promotor P3, se geneticamente manipulado, poderia trazer mudanças fisiológicas somente posteriormente no desenvolvimento. Os achados deste estudo fornecem uma compreensão adicional da biologia do desenvolvimento de embriões derivados de PIV, bem como novas possibilidades para o uso da expressão dos diferentes promotores do gene IGF2 para a manipulação genética durante estádios preimplantacionais de embriões bovinos, o que pode ser um caminho para estudos que visam o aumento da viabilidade e a redução da mortalidade embrionária no início da gestação pela modulação da taxa de crescimento após a produção embrionária in vitro.

The splicing of messenger RNA precursors to mature mRNA is a critical component of the gene regulation that can encode distinct protein or affect mRNA stability, localization, and translation. Correlations between the higher early embryonic mortality in in vitro-produced (IVP) embryos with the growth retardation of the conceptus and reduced expressions of IGF2 with placental and fetal abnormalities in the fetal phase in development have already been established. The IGF2 locus is a complex genomic region that produces multiple alternative splicing transcripts of several leader exons controlled by four distinct promoters. The present study evaluated the pattern of the promoter-specific IGF2 expression in bovine oocytes and in preimplantation embryos, as a means of unraveling some aspects of the developmental physiology of bovine embryos produced in vitro. To describe the behavior of the IGF2 gene, IVP-derived structures from distinct stages of development, from immature oocytes to expanded blastocyst, were collected in three IVP procedures, in pools of five structures per stage. Total RNA was extracted from the pools and reverse transcribed in cDNA, which were evaluated to estimate the abundance of the four different IGF2 mRNA isoforms by real time quantitative PCR system (qPCR), using IGF2 promoterspecific primers. Amplifications were DNA sequenced for confirmation. Data comprising quantitative IGF2 isoform expression were log transformed for normality and analyzed by the Mixed Procedure of SAS, with pairwise comparisons by LSM, for P<0.05. Promoter P2 and P4 IGF2 expression followed the pattern seen in active mRNA of IGF2 gene. An initial peak could be seen in early development, between matured oocytes and 2-cells stage embryos, mostly from accumulation prior to fertilization, followed by a decrease in abundance until embryo genome activation, at the 8-cells stage embryo. Then, a new surge in splicing variants could be detected at compaction and cavitation. Promoter P1 IGF2 expression showed to be less representative at the initial stages, having a notorious increase during compaction, after genomic activation, prior to cavitation. Differently, Promoter P3 activity was not detected at all stages, possibly being more relevant at more advanced stages in development. Future genetic studies focused on early embryonic development should pay especial attention to the role of the P4 promoter for IGF2 expression, with the P1 and P2 promoters having an apparent secondary role during early development, whereas the P3 promoter, if genetically manipulated, could possibly bring physiological changes only latter in development. The findings of this study provide some further understanding of aspects in developmental biology for IVP-derived embryos, also offering novel possibilities for the use of promoter-specific IGF2 expression for genetic manipulation during preimplantation embryo stages in cattle, which may be a path for studies seeking an increase in embryo viability and reduction of embryo mortality in early pregnancy by the modulation of growth rate after in vitro embryo production.