Avaliação do medicamento anti-hipertensivo doxazosina como potencial agente antiproliferativo nas células estreladas hepáticas

Abstract

A fibrose hepática é caracterizada pelo acúmulo de matriz extracelular (MEC) após lesão hepática crônica e pode levar à cirrose. As células estreladas hepáticas (HSC) desempenham um papel crucial durante a fibrogênese, alterando seu fenótipo quiescente para um fenótipo ativado para proteger áreas saudáveis das áreas danificadas. Estratégias para controlar a fibrose hepática envolvem a promoção de apoptose e/ou o retorno ao estado de quiescência das HSC ativadas. A doxazosina é um anti-hipertensivo, antagonista dos receptores alfa-1 adrenérgicos, que também possui efeitos antifibróticos e pró-apoptóticos. Neste estudo, através da estratégia de reposicionamento de fármacos, buscamos avaliar os efeitos da doxazosina nas HSC. Para isso, foram utilizadas duas linhagens celulares de HSCs: LX-2 (humana) e GRX (murina). O efeito da doxazosina sobre a viabilidade e a proliferação destas células foi determinado através dos ensaios de MTT e Sulforrodamina B (SRB), depois de estabelecida uma curva de concentração em função do tempo de exposição ao fármaco. Definimos o tempo de 48 horas e escolhemos as concentrações de 18, 27, 36 e 45 μM para LX-2 e de 13.5, 18, 27 e 36 μM para GRX. A partir dos valores de MTT, determinamos o IC50. A partir do IC50, escolhemos a concentração para avaliação da morte celular: 13.5 μM para GRX e 27 μM para LX-2. Os resultados do MTT e SRB, nas duas linhagens, demonstraram diminuição significativa na viabilidade e confluência. A análise da morte celular mostrou que nas LX-2, esse efeito está relacionado com indução de apoptose. Porém, nas GRX, a análise morfométrica nuclear sugere a indução de senescência celular, observada pelos núcleos aumentados no tratamento com doxazosina. A confirmação da indução de senescência celular será feita através da atividade da β-galactosidase. Como perspectivas futuras, pretendemos, em ambas as linhagens, determinar o quanto o tratamento interfere no estado de ativação das células, pela expressão de proteínas marcadoras de ativação como, α-SMA, colágeno tipo I e TGF-β.

Hepatic fibrosis is characterized by the accumulation of extracellular matrix (ECM) after chronic liver injury and can lead to cirrhosis. Hepatic stellate cells (HSC) play an essential role in fibrogenesis, change their quiescent phenotype to an activated phenotype to protect healthy areas from damaged areas. Strategies to control liver fibrosis involve the promotion of apoptosis and/or the return to the quiescence state of activated HSC. Doxazosin is an antihypertensive, alpha-1-adrenergic receptor antagonist, which also has antifibrotic and pro-apoptotic effects. In this study, through the drug repositioning strategy, we assess the effects of doxazosin on HSC. Were used two cell lines of HSC: LX-2 (human) and GRX (murine). The effect of doxazosin on the viability and proliferation of these cells was determined using MTT and Sulforhodamine B (SRB) assays, after establishing a concentration curve as a function of drug exposure time. We defined the time of 48 hours and chose the concentrations of 18, 27, 36 and 45 μM for LX-2 and 13.5, 18, 27 and 36 μM for GRX. We determine the IC50 from the MTT values. The results of MTT and SRB, in both lineages, showed a significant decrease in viability and confluence. The analysis of cell death showed that in LX-2, this effect is related to induction of apoptosis. However, in GRX, the nuclear morphometric analysis showed the induction of cell senescence, observed by the enlarged nuclei in the treatment with doxazosin. Confirmation of cell senescence induction will be done through the activity of β-galactosidase. Future perspectives are to assess how much the treatment interferes in the state of cell activation, through the expression of activation marker proteins such as α-SMA, type I collagen and TGF-β.