Efeito a curto prazo da hipotermia terapêutica em ratos machos e fêmeas submetidos ao modelo de hipóxia-isquemia encefálica neonatal

Abstract

A hipóxia-isquemia (HI) é uma das principais causas de óbitos e sequelas neurológicas em recém-nascidos. Além disso, em modelos animais de HI, foram observadas diferenças entre machos e fêmeas em relação à gravidade da lesão cerebral. O único tratamento recomendado para a HI neonatal é a hipotermia terapêutica (HT), que consiste na redução da temperatura corporal para 33,5ºC-34,5ºC por 72 horas. Como a HT apresenta algumas limitações, um melhor entendimento de seus efeitos específicos em machos e fêmeas é importante para o aprimoramento de sua aplicação clínica. O presente estudo avaliou o efeito do tratamento com HT a curto prazo sobre a lesão cerebral e os desfechos comportamentais em ratos neonatos machos e fêmeas submetidos ao modelo de HI neonatal. Ratos Wistar machos e fêmeas com sete dias de idade (P7) foram distribuídos em três grupos experimentais: SHAM (animais submetidos à cirurgia fictícia), HI (animais submetidos ao procedimento HI) e HT (animais submetidos ao procedimento de HI e tratados com HT). Para a HI, os filhotes foram submetidos à cirurgia de oclusão unilateral da artéria carótida comum direita e expostos a uma atmosfera hipóxica (8% de oxigênio) por 75 minutos. Após um período de recuperação, os animais do grupo HT foram submetidos à HT (temperatura corporal reduzida para 32ºC) por 5 horas. Em P8, as respostas reflexas dos animais foram avaliadas usando os testes de reflexo de endireitamento, geotaxia negativa e aversão à borda. O teste de discriminação olfatória também foi realizado. Os animais foram eutanasiados em P9 e foram coletados os encéfalos, para as análises de volume de lesão, contagem de neurônios pela técnica de Nissl e avaliação da degeneração neuronal pela técnica de Fluoro-Jade B. Os dados paramétricos foram analisados por ANOVA de uma via seguida do post hoc de Tukey para comparações múltiplas; os dados não-paramétricos foram avaliados por Kruskall-Wallis seguido do teste Dunn. A significância aceita foi de p<0,05. De forma geral, nos testes comportamentais não foram observadas diferenças significativas desencadeadas pela HI ou HT, apenas no reflexo de endireitamento, no qual as fêmeas do grupo HI apresentaram menor latência. Nas análises do volume de lesão encefálica indireta, a HT reduziu o % de lesão produzida pela HI nos machos. Nas contagens do número de neurônios, os animais do grupo HI tiveram uma redução no número total de neurônios, quando comparados ao grupo SHAM tanto em machos quanto em fêmeas, nas regiões de CA1 e giro denteado (GD) do hipocampo; entretanto, nos machos e nas fêmeas na região de CA1 a HT preveniu parcialmente a morte neuronal. Na contagem de células Fluoro-Jade+, na região de CA1, os animais do grupo HI tiveram mais células em degeneração, o que foi revertido pela HT nas fêmeas. No GD, os animais machos do grupo HI apresentaram uma maior quantidade de células Fluoro-Jade+, o que foi revertido pela HT. A partir desse trabalho foi possível concluir que o modelo utilizado de HI causou lesão encefálica nos animais submetidos à hipóxia-isquemia neonatal e que a HT atenuou a lesão encefálica. Embora a HT não tenha mostrado um impacto significativo nas análises comportamentais, fica claro que o tratamento é benéfico em nível celular/tecidual. Os resultados também deixam clara a importância da avaliação separada de machos e fêmeas com o intuito de traçar estratégias de tratamento específicas para cada um dos sexos.

Hypoxia-ischemia (HI) is one of the main causes of death and neurological sequelae in newborns. Furthermore, in animal models of HI, differences were observed between males and females regarding the severity of brain injury. The only recommended treatment for neonatal HI is therapeutic hypothermia (TH), which consists of reducing body temperature to 33.5ºC-34.5ºC for 72 hours. As TH has some limitations, a better understanding of its specific effects in males and females is important to improve its clinical application. The present study evaluated the effect of short-term TH treatment on brain injury and behavioral outcomes in male and female neonatal rats submitted to the neonatal HI model. Seven-day-old male and female Wistar rats (P7) were divided into three experimental groups: SHAM (animals submitted to sham surgery), HI (animals submitted to the HI procedure), and TH (animals submitted to the HI procedure and treated with TH). For HI, the pups underwent unilateral right common carotid artery occlusion surgery and were exposed to a hypoxic atmosphere (8% oxygen) for 75 minutes. After a recovery period, the animals in the TH group were submitted to TH (body temperature reduced to 32ºC) for 5 hours. At P8, the animals' reflex responses were assessed using the righting reflex, negative geotaxis, and cliff avoidance. The olfactory discrimination test was also performed. The animals were euthanized at P9 and the brains were collected for analysis of lesion volume, neuron counting using the Nissl technique, and evaluation of neuronal degeneration using the Fluoro-Jade B technique. Parametric data were analyzed by one-way ANOVA followed by Tukey's post hoc for multiple comparisons; non-parametric data were evaluated by Kruskall-Wallis followed by the Dunn test. The accepted significance was p<0.05. In general, in the behavioral tests, no significant differences were observed triggered by HI or TH, only in the righting reflex, in which the females of the HI group presented lower latency. In the analysis of the volume of indirect brain injury, TH reduced the % of injury produced by HI in males. In the counting of the number of neurons, the animals of the HI group had a reduction in the total number of neurons, when compared to the SHAM group in both males and females, in the CA1 and dentate gyrus (DG) regions of the hippocampus; however, in males and females in the CA1 region, TH partially prevented neuronal death. In the Fluoro-Jade+ cell count, in the CA1 region, the animals in the HI group had more degenerating cells, which was reversed by TH in females. In DG, male animals from the HI group had a greater amount of Fluoro-Jade+ cells, which was reversed by TH. Then, it was possible to conclude that the neonatal HI model lead to a brain injury and that TH attenuated the brain injury. Although TH did not show a significant impact in behavioral analyses, it is clear that the treatment is beneficial at a cellular/tissue level. The results clarify the importance of separate assessments of males and females to outline specific treatment strategies for both sexes.