Caracterização físico-química, desenvolvimento e validação de métodos analíticos para dois novos derivados dos ácidos betulínico e ursólico com atividade antimalárica

Abstract

Considerada endêmica em mais de 90 países e territórios, a malária é a doença parasitária mais abrangente, em termos geográficos e populacionais, do mundo. Segundo a OMS, mais de 200 milhões de pessoas são infectadas por ano e há estimativa de 400 mil óbitos no mesmo período. A resistência do plasmódio aos fármacos disponíveis é reconhecida como um dos maiores problemas para a erradicação da malária. Com intuito de encontrar novos fármacos, SILVA e colaboradores (2013) sintetizaram duas séries de análogos aos triterpenos ácido betulínico (AB) e ácido ursólico (AU) para melhorar a atividade terapêutica destas moléculas, reduzir a toxicidade e procurar por novos alvos terapêuticos. O estudo investigou a substituição de ésteres no carbono-3 dos ácidos e avaliou a atividade antimalárica, resultando em moléculas com bom potencial de ação, designadas ácido 3-O-butanoilbetulínico (3-OBB) e ácido 3-O-butanoilursólico (3-OBU). Estas moléculas foram semissintetizadas, caracterizadas fisico-quimicamente e métodos analíticos foram desenvolvidos e validados para a identificação e quantificação destes protótipos. A avaliação por ponto de fusão capilar e calorimetria diferencial exploratória (DSC) resultou em caracterização térmica do composto 3-OBB, porém, devido a degradações moleculares, não foi efetiva na avaliação do composto 3-OBU. A identidade das moléculas foi confirmada por espectroscopia no ultravioleta e infravermelho, além de ressonância magnética nuclear de 1H e 13C, resultando em espectros característicos e assimiláveis à estrutura química dos fármacos. Devido à ausência de padrão de referência compendial, um balanço de massas é proposto para identificar a pureza dos compostos sintetizados, resultando em pureza de 94,56% e 83,38% para os compostos 3-OBB e 3-OBU, respectivamente. O método analítico foi desenvolvido por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), acoplado a detectores ultravioleta (UV) e aerossol carregado (DAC), em série. O sistema cromatográfico, operado isocraticamente e em fase reversa, consistiu em fase móvel composta por acetonitrila:água pH 3,0 ajustado com ácido fórmico (85:15, v/v), com fluxo de 1,2 mL/min e coluna PhenoSphere Next octadecilsilano (250 mm x 4,6 mm de diâmetro e 5 μm de tamanho de partícula). Os cromatogramas foram registrados em 210nm, com amostras de 3-OBB e 3-OBU, avaliadas simultaneamente, na concentração de 50 μg/mL, com volume de injeção de 20 μL e sob temperatura controlada de 50 °C. O tempo de análise cromatográfica foi de 30 min. O método se mostrou específico, linear, preciso e exato para ambos os analitos, 3-OBB e 3-OBU, e foi considerado estatisticamente validado, podendo ser utilizado identificação e quantificação dos novos fármacos.

Endemic in more than 90 countries and territories, malaria is the most widely, populational and geographically, parasitic disease in the world. According to the WHO, more than 200 million people are infected each year and an estimated 400.000 deaths occur in the same period. Plasmodio resistance to available drugs is recognized as one of the major problems for malaria eradication. In order to find new drugs, SILVA and collaborators (2013) synthesized two series of analogues to the betulinic acid (BA) and ursolic acid (UA) triterpenes to improve the therapeutic activity of these molecules, reduce toxicity and search for new therapeutic targets. The study investigated ester substitution on carbon-3 of BA and UA, resulting in molecules with good antimalarial activity, designed 3-O-butanoilbetulinic acid (3-OBB) and 3-O-butanoilursolic acid (3- OBU). These molecules were semisynthesized, physic-chemically characterized and an analytical method was developed and validated for the identification and quantification of these prototypes. An evaluation by capillary melting point and differential scanning calorimetry (DSC) resulted in thermal characterization of 3-OBB compound, but due to molecular degradations, was not effective in the evaluation of compound 3-OBU. The identity of the molecules was confirmed by ultraviolet and infrared spectroscopy, as well as 1H and 13C nuclear magnetic resonance, resulting in characteristic and assimilable spectra to the chemical structure of the drugs. Due to the absence of compendial reference standard, a mass balance is proposed to identify the purity of the synthesized compounds, resulting in 94.56% and 83.38% of 3-OBB and 3-OBU, respectively. Analytical method was developed by high performance liquid chromatography (HPLC), coupled, in series, to ultraviolet (UV) and charged aerosol (CAD) detectors. Chromatographic system, operated isocratically by reversed phase, consisted on a mobile phase composed of acetonitrile: water pH 3.0 adjusted with formic acid (85:15, v/v), flow rate of 1.2 mL/min and a PhenoSphere Next octadecylsilane column (250 mm x 4.6 mm internal diameter and 5 μm particle size). The chromatograms were recorded at 210 nm with 3-OBB and 3-OBU samples, simultaneously evaluated, at a concentration of 50 μg/mL, an injection volume of 20 μL at a controlled temperature of 50 ° C. The chromatographic analysis time was set at 30 min. The method was found to be specific, linear, precise and accurate for both analytes, 3-OBB and 3-OBU, and was considered statistically validated, so it can be applied in the identification and quantification of the new drugs.