Efeito das ureases de soja (Glycine max (L.) Merr.) na germinação de sementes e desenvolvimento das plantas

Abstract

As ureases produzidas por plantas, fungos e bactérias, são metaloenzimas níquel- dependentes que catalisam a hidrólise da uréia em amônia e dióxido de carbono. Existem três proteínas de urease em soja. A urease ubíqua codificada pelo gene Eu4 é expressa em baixos níveis em todos os tecidos da planta e tem sido considerada responsável pela reciclagem de toda a uréia derivada metabolicamente. A urease embrião-específica codificada pelo gene Eu1 é expressa em níveis elevados em embriões em desenvolvimento e sementes maduras. Um terceiro gene codificando urease foi recentemente identificado. Este gene foi nomeado Eu5, e seu produto SBU-III. Eu5 é expresso nos primeiros estágios de desenvolvimento das raízes, mas o seu nível de expressão é menor se comparado ao de outras isoformas de urease. Plantas transgênicas com a supressão da expressão de Eu4 foram previamente obtidas por nossa equipe. Estas plantas transgênicas representam uma ferramenta poderosa para a genomica funcional, porque mutantes nulos nunca tinham sido obtidos para a urease ubíqua. Os objetivos do presente estudo foram caracterizar em nível molecular as progênies de plantas transgênicas com Eu4 co-suprimido e investigar o papel das ureases na capacidade de germinação de sementes e desenvolvimento das plantas. Sementes T1 e T2 obtidas de plantas transgênicas T0 e T1, respectivamente, foram selecionadas por expressão do gene repórter gfp. A presença de transgenes também foi confirmada por PCR. Níveis de expressão das três isoformas da urease (Eu4, Eu1 e Eu5) foram avaliados por RT-qPCR. Os resultados mostraram que co-supressão de Eu4 foi mantida na progênie transgênica. O silenciamento dos outros dois genes codificando ureases foi também demonstrado nessas plantas. A fim de investigar o papel individual dos genes que codificam urease nos processos de germinação e de desenvolvimento das plantas, mutantes simples eu4, eu1 e duplo eu4/eu1 foram também avaliados. Os resultados sugerem que a ausência de uma ou mais isoformas de urease não afetou a viabilidade das sementes, mesmo depois de armazenadas. Por outro lado, uma grande contribuição de Eu1 e Eu5 no padrão temporal de desenvolvimento das plantas foi demonstrada. A ausência de Eu1 determinou um atraso nos primeiros estágios de desenvolvimento, enquanto que nas plantas com silenciamento de todos os três genes que codificam ureases este fenótipo foi estendido para estágios de desenvolvimento subsequentes. Há sugestão na literatura de que Eu5 não seja funcional uma vez que elevado número de mutações têm sido detectados neste gene. No entanto, de acordo com nossos resultados, o produto deste gene pode estar envolvido no desenvolvimento da planta.

Urease, produced by plants, fungi and bacteria, is a nickel-dependent metalloenzyme that catalyzes the hydrolysis of urea to ammonia and carbon dioxide. There are three urease structural proteins in soybean. The ubiquitous urease encoded by Eu4 gene is expressed at low levels in all plant tissues and has been considered to be responsible for recycling all metabolically-derived urea. The embryo-specific urease encoded by Eu1 gene is expressed in high levels in developing embryos and ripe seeds. A third urease encoding gene was recently identified. This gene was named Eu5, and its product SBU-III. Eu5 is expressed in the first stages of root development, but its expression level is lower if compared to that of other urease isoforms. Transgenic plants with suppression of Eu4 expression were previously obtained by our team. These transgenic plants represent a powerful tool for functional genomics, because null mutants have never been obtained for the ubiquitous urease. The goals of the present study were to characterize at molecular level progenies of transgenic Eu4 co-suppressed plants and investigate the role of ureases on seed germination capacity and plant development. T1 and T2 seeds obtained from T0 and T1 transgenic plants, respectively, were screened for gfp-reporter gene expression. Presence of transgenes was also confirmed by PCR. Expression levels of the three urease isoforms (Eu4, Eu1 and Eu5) were evaluated by RT-qPCR. Results showed that Eu4 co-suppression was maintained in the transgenic progeny. Silencing of the other two ureases encoding genes was also demonstrated in those plants. In order to investigate the role of individual urease encoding genes on germination and plant developmental processes, eu4, eu1 single and eu4/eu1 double mutants were also evaluated. Results suggest that lack of one or more ureases isoforms did not affect seed capacity even after stored. On the other hand, a great contribution of Eu1 and Eu5 on temporal plant developmental pattern was demonstrated. The lack of Eu1 determined a delay in the first developmental stages, whereas silencing of all three soybean ureases encoding genes distended this phenotype for further growth stages. Eu5 has been suggested not to be functional as it presents high number of mutations. However, according to our results the product of this gene might be involved on plant development.