Dinâmica de formação de biofilmes multiespécies de Salmonella enteritidis, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes e Escherichia coli e efeitos de procedimentos de higienização

Abstract

A carne de frango pode servir de veículo para inúmeros microrganismos patogênicos como Salmonella spp., Campylobacter spp., Escherichia coli, Listeria monocytogenes, entre outros, potencialmente capazes de desencadear doenças transmitidas por alimentos. Estes microrganismos podem se aderir em superfícies bióticas e abióticas, formando biofilmes. Microrganismos, na forma de biofilme, são mais resistentes a adversidades ambientais, como falta de nutrientes e variações de temperatura, além de serem mais resistentes à sanitizantes químicos e físicos. Na indústria avícola, procedimentos de higienização, incluindo limpeza e desinfecção, são fundamentais para reduzir o número de microrganismos a um nível seguro. A sanitização, pelo uso de água quente, detergentes e sanitizantes, é a última etapa do procedimento de higienização com a finalidade de garantir um produto de boa qualidade higiênicosanitária. Porém, falhas na etapa de higienização levam a permanência de resíduos de alimentos nos equipamentos e sob determinadas condições, os microrganismos se aderem, interagem com as superfícies de processamento e iniciam a formação de biofilmes. Na primeira etapa deste estudo, foi realizada uma triagem entre as amostras de Salmonella Enteritidis, Escherichia coli, Listeria monocytogenes e Campylobacter jejuni quanto à capacidade de formação de biofilme monoespécie em placa de poliestireno, pela coloração de cristal violeta. As amostras foram classificadas como: não aderentes, fracamente, moderadamente e fortemente formadoras de biofilmes nas temperaturas de 3°C, 9°C, 25°C, 36°C e 42°C e foram selecionadas 4 cepas formadoras de biofilme de cada espécie. Na segunda etapa, as 4 cepas selecionadas foram testadas individualmente quanto a sua resistência aos sanitizantes peróxido de hidrogênio a 0,3% e hipoclorito de sódio a 2%, para avaliar a eficácia destes sanitizantes em células na fase planctônica. A maioria das cepas foram resistentes ao peróxido de hidrogênio a 0,3%, com exceção de C. jejuni. Quanto ao hipoclorito de sódio a 2%, apenas a amostra de Listeria monocytogenes foi resistente. Na terceira etapa, 4 cepas selecionadas foram testadas quanto a formação de biofilme multiespécie, nas superfícies de aço inoxidável, poliuretano e polietileno, coletadas de matadouro-frigorífico avícola, nas temperaturas de 42±1ºC, 36±1ºC, 25±1ºC, 9±1ºC e 3±1ºC, e nos intervalos de tempo 0, 4, 12 e 24 horas, utilizando microbiologia convencional. Além disso, perante a formação de biofilme, foi avaliada a eficácia dos procedimentos de higienização mimetizados nas diferentes condições ambientais, verificando a sensibilidade destes biofilmes frente aos tratamentos com água quente a 85ºC, hipoclorito de sódio a 2% e peróxido de hidrogênio a 0,3%. As cepas de S. Enteritidis, E. coli e L. monocytogenes foram capazes de formar biofilme multiespécie, com maior prevalência de S. Enteritidis, considerando todas as temperaturas testadas. As superfícies de polietileno e poliuretano proporcionaram formação de biofilme estatisticamente semelhantes, onde o polietileno foi a superfície mais difícil de higienizar. O aço inoxidável proporcionou menos adesão interespécie e foi mais facilmente higienizado. Os sanitizantes hipoclorito de sódio a 2% e a água quente a 85°C possuíram eficácia semelhante nas superfícies testadas. O peróxido de hidrogênio não demonstrou eficácia na higienização das superfícies. Estes resultados são de grande relevância para estimular novas estratégias de higienização diante de biofilmes em matadouro-frigoríficos avícolas e para instigar outros estudos de formação de biofilme multiespécie.

The poultry meat can serve as a vehicle for numerous pathogens such as Salmonella, Campylobacter spp, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, among others, potentially capable of triggering foodborne illness. These microorganisms can adhere to biotic and abiotic surfaces forming biofilms. Microorganisms in biofilms are more resistant to environmental adversities, such as starvation of nutrients and temperature variations as well as being more resistant to physical and chemical sanitizers. In the poultry industry, cleaning procedures, including cleaning and disinfection are essential to reduce microorganisms to a safe level. The sanitization, by the use of hot water, detergents and chemical and physical sanitizers is the last step of the cleaning procedure in order to ensure product of good sanitary conditions. However, failures in sanitizing step lead to permanence of food residues in equipment and under certain conditions, microorganisms adhere interact with the surfaces of processing and trigger the biofilms formation. In the first step of this study, screening was performed for the strains of Salmonella Enteritidis, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, and Campylobacter jejuni as monospecies biofilm formation capacity in the polystyrene plate by crystal violet staining. Strains were classified in: nonadherent weakly, moderately and strongly forming biofilms in temperature of 3°C, 9°C, 25°C, 36°C and 42°C and selected 4 strains forming biofilms by species. In the second step, the 4 selected strains were tested individually as their resistance to the sanitizers of hydrogen peroxide at 0.3% and sodium hypochlorite at 2% for the effectiveness of these sanitizers with cells in planktonic phase. Most strains were resistant to hydrogen peroxide at 0.3%, with the exception of C. jejuni, which was sensitive to action this sanitizer. As for the sodium hypochlorite at 2%, only L. monocytogenes was resistance and the rest of the strains were sensitive to the action of sanitizing. In the third stage, the 4 selected strains were tested for the formation of multispecies biofilms on the surfaces of: stainless steel, polyurethane and polyethylene collected from poultry slaughterhouse, incubated at temperatures of 42±1ºC, 36±1ºC, 25±1ºC, 9±1ºC e 3±1ºC, and ±1°C, and the time slots 0, 4, 12 and 24 hours, using conventional microbiology. Moreover, the effectiveness of simulated hygiene procedures in the different environmental conditions was evaluated by checking the sensitivity of the biofilms to the treatments with hot water at 85°C, sodium hypochlorite at 2% and hydrogen peroxide at 0.3%. The strains of S. enteritidis, E. coli and L. monocytogenes were able to form multi-species biofilm, with higher prevalence of S. Enteritidis, considering all temperatures tested. The surfaces of polyethylene and polyurethane provided statistically similar biofilm formation, where the polyethylene was the hardest surface to sanitize. Stainless steel interspecies provided less adhesion and is more easily sanitized. Sanitizers sodium hypochlorite at 2% and hot water at 85 ° C possessed similar efficacy at the tested surfaces. Hydrogen peroxide has not demonstrated efficiency in the cleaning of surfaces. These results are of great importance to promote new strategies for cleaning before biofilms in poultry slaughterhouses and to instigate other multispecies biofilm formation studies.