Caracterização do gene OsbHLH35 e dos fatores de transcrição envolvidos na regulação de sua expressão

Abstract

As espécies reativas de oxigênio (ERO) são subprodutos usuais do metabolismo aeróbico e estão envolvidas em rotas de transdução de sinal, porém, podem reagir com macromoléculas biológicas causando danos celulares. Portanto, seus níveis devem ser estritamente controlados. Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram que plantas silenciadas nas ascorbato peroxidases citosólicas, APX1 e APX2, possuem níveis aumentados de H2O2, entretanto, essas plantas não apresentam fenótipos de estresse, sugerindo que existe um mecanismo de compensação à diminuição da atividade de APX. Análises de transcriptoma mostraram a expressão diferencial de 58 genes, entre eles, o gene OsbHLH35 teve sua expressão induzida nessas plantas. A caracterização funcional dos genes diferencialmente expressos nessas plantas contendo níveis alterados de peróxido de hidrogênio pode revelar os mecanismos compensatórios induzidos nessas plantas que permitem que as mesmas de desenvolvam normalmente. Além disso, o estudo da regulação da expressão desses genes diferencialmente expressos pode permitir entender como a alteração do estado redox da célula é percebido e transduzido. Dessa maneira, o gene OsbHLH35 foi caracterizado funcionalmente, assim como os fatores de transcrição que regulam a sua expressão, visando a contribuir para a elucidação dos mecanismos de defesa sinalizados pelo peróxido de hidrogênio. A expressão do gene OsbHLH35 foi avaliada em resposta a diferentes estresses, tendo sido demonstrada a modulaçao de sua expressão em resposta à salinidade, à dessecação, ao ABA, à luz UV-B, ao H2O2, e ao frio. No intuito de identificar os fatores de transcrição responsáveis pela regulação da expressão do gene OsbHLH35, um fragmento do promotor foi submetido a experimentos de mono-híbrido em levedura e foram identificados quatro fatores de transcrição como reguladores putativos da sua expressão, OsGRF3, OsGRF4, OsGRF11 e IDEF1. A ligação dos fatores de transcrição ao promotor de OsbHLH35 foi confirmada em ensaios de mono-híbrido, e OsGRF11 foi capaz de reprimir a transcrição do gene repórter em ensaios de transativação. A análise de plantas silenciadas via RNAi nos genes OsGRF3 e OsGRF4 revelou que, além de tamanho reduzido, essas plantas produzem menor número de panículas que as plantas WT. Além disso, plantas superexpressando OsbHLH35 e OsGRF11 foram geradas. Até o momento, as plantas atingiram a fase de florescimento, no entanto, não produziram sementes. O estudo da história evolutiva da família GRF em Viridiplantae revelou que essa família existe pelo menos desde as algas carófitas, tendo sofrido uma expansão nas plantas terrestres, principalmente com duplicações nos ancestrais das monocotileôneas e das eudicotiledôneas, e que eventos de WGD tiveram importância na expansão dessa família. Além disso, sugerimos a origem do GRF ancestral a partir da subunidade SNF2 do complexo de remodelamente da cromativa SWI2/SNF2, provavelmente em uma duplicação no ancestral das carófitas.

Reactive oxygen species (ROS) are common byproducts of aerobic metabolism and are involved in signal transduction pathways; however, they may react with biological macromolecules causing cellular damage. Therefore, their levels should be strictly controlled. Previous studies of our group have shown that plants silenced in the ascorbate cytosolic peroxidases, APX1 and APX2, have increased levels of H2O2. However, these plants do not present stress phenotypes, suggesting that there is a mechanism of compensation for the decrease in APX activity. Transcriptome analyses showed the differential expression of 58 genes, among them, the OsbHLH35 gene had its expression induced in these plants. The functional characterization of genes differentially expressed in these plants, containing altered levels of hydrogen peroxide, may reveal the compensatory mechanisms induced in the plants that allow them to develop normally. Also, the study of the regulation of the expression of these differentially expressed genes may allow understanding how alteration of the redox state of the cell is perceived and transduced. In this way, the OsbHLH35 gene was functionally characterized, as well as the transcription factors that regulate its expression, aiming to contribute to the elucidation of the defense mechanisms signaled by hydrogen peroxide. Expression of the OsbHLH35 gene was evaluated in response to different stresses, modulating its expression in response to salinity, desiccation, ABA, UV-B light, H2O2, and cold. To identify the transcription factors responsible for the regulation of OsbHLH35 expression, a fragment of its promoter was used in yeast one-hybrid assays. Four transcription factors were identified as putative regulators of its expression, OsGRF3, OsGRF4, OsGRF11, and IDEF1. Binding of the transcription factors to the OsbHLH35 promoter was confirmed in yeast one-hybrid assays, and OsGRF11 was able to repress the transcription of the reporter gene in transactivation assays. The analysis of plants silenced by RNAi in the genes OsGRF3 and OsGRF4 revealed that, in addition to reduced size, these plants produce fewer panicles than WT plants. Also, we generated plants overexpressing OsbHLH35 and OsGRF11. So far, the plants have reached the flowering stage; however, they have not produced seeds. The study of the evolutionary history of the GRF family in Viridiplantae revealed that this family existed at least since charophyte algae, having undergone an expansion in land plants, mainly with duplications in the ancestors of monocots and eudicots, and that events of WGD were important for the expansion of this family. In addition, we suggested the origin of the ancestral GRF from the SNF2 subunit of the remodeling complex SWI2/SNF2, probably in a duplication in the ancestor of the charophytes.