Avaliação do efeito inibitório e da expressão de genes associados à resistência de Listeria monocytogenes exposta à nisina nas formas livre e nanoencapsulada em lipossomos de fosfatidilcolina

Abstract

A listeriose, causada pela bactéria Listeria monocytogenes, constitui uma importante doença transmitida por alimentos (DTA), podendo causar hepatite subclínica em indivíduos hígidos, aborto em gestantes e meningite, encefalite, rombencefalite e óbito em indivíduos imunodebilitados ou imunodeficientes. Segundo o Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC), o número de casos anuais de listeriose invasiva nos EUA é em torno de 1.600 ocorrências, com uma taxa de mortalidade de 16,2% e segundo o Rapid Alert System for Food and Feed (RASFF), na união européia, cerca de 2.500 ocorrências anuais, também com uma taxa de mortalidade de 16,2%. Nisina é um peptídeo antimicrobiano catiônico (CAMP) autorizado pelo Food and Drug Administration (FDA) para uso como conservante alimentar, bastante eficaz contra L. monocytogenes. O presente trabalho tem como objetivo avaliar o efeito inibitório (OD/UFC) e a expressão de genes associados à resistência (RT-qPCR) de L. monocytogenes exposta à nisina nas formas livre e nanoencapsulada em lipossomos de fosfatidilcolina do tipo vesículas unilamelares grandes (LUVs). Para isso, foram produzidas amostras contemplando 4 condições experimentais distintas: A ausência de nisina, nisina livre (100 mg/L e 1 mg/L), lipossomo branco e nisina nanoencapsulada. Foi demonstrada a ocorrência de forte redução do efeito inibitório da nisina nanoencapsulada comparativamente à nisina livre, inclusive com aumento da taxa de crescimento acima do cultivo sem nisina, sugerindo que possivelmente a fosfatidilcolina esteja promovendo o enriquecimento do meio de cultivo. Tanto a resposta temporal como o estudo dose dependente, demonstraram um forte aumento na expressão dos genes sigB e ctsR (361% e 319% na resposta temporal e 512% e 576% no estudo dose dependente, respectivamente) e uma forte redução na expressão dos genes virR, kat e lmo1433 (57%, 89% e 91% na resposta temporal e 59%, 87% e 81% no estudo dose dependente, respectivamente), sugerindo que nos cultivos com nisina livre a modulação da resistência à nisina possivelmente seja realizada através de sigB e sugerindo que as defesas contra o estresse oxidativo possivelmente não tenham muita contribuição para a resistência à nisina. Com relação à expressão gênica diferencial entre nisina nanoencapsulada e nisina livre 100 mg/L, foi demonstrado um aumento extremamente forte na expressão de ctsR, dnaA e virR (2.004%, 1.500% e 4.764%, respectivamente), um aumento muito forte na expressão de prfA e lmo1433 (583% e 234%, respectivamente) e uma redução muito forte na expressão de kat (32%), sugerindo que nos cultivos com a sinalização da fosfatidilcolina, a modulação da resistência à nisina possivelmente seja realizada, além de sigB, através do aumento na expressão de viR, sugerindo que possivelmente o microrganismo esteja interpretando erroneamente estar no hospedeiro, aumentando a expressão dos fatores de virulência através do regulador prfA e corroborando que possivelmente a fosfatidilcolina esteja promovendo o enriquecimento do meio de cultivo.

Listeriosis, caused by the bacterium Listeria monocytogenes, is an important foodborne disease (FBD), which can cause subclinical hepatitis in healthy individuals, abortion in pregnant women and meningitis, encephalitis, rhombencephalitis and death in immunodeficient or immunodeficient individuals. According to the Center for Disease Control and Prevention (CDC), the number of annual cases of invasive listeriosis in the USA is around 1,600 occurrences, with a mortality rate of 16.2% and according to the Rapid Alert System for Food and Feed (RASFF), in the European Union, about 2,500 annual occurrences, also with a mortality rate of 16.2%. Nisin is a cationic antimicrobial peptide (CAMP) authorized by the Food and Drug Administration (FDA) for use as a food preservative, quite effective against L. monocytogenes. The present work aims to evaluate the inhibitory effect (OD/UFC) and expression of resistance-associated genes (RT-qPCR) of L. monocytogenes exposed to nisin in free and nanoencapsulated in large unilamellar vesicle-type (LUV) phosphatidylcholine liposomes forms. For that, samples were produced contemplating 4 different experimental conditions: The absence of nisin, free nisin (100 mg/L and 1 mg/L), white liposome and nanoencapsulated nisin. A strong reduction in the inhibitory effect of nanoencapsulated nisin has been demonstrated compared to free nisin, including an increase in the growth rate above the culture without nisin, suggesting that possibly the phosphatidylcholine is promoting the enrichment of the culture medium. Both the temporal response and the dose dependent study demonstrated a strong increase in the expression of the sigB and ctsR genes (361% and 319% in the temporal response and 512% and 576% in the dose dependent study, respectively) and a strong reduction in the expression of virR, kat and lmo1433 genes (57%, 89% and 91% in the temporal response and 59%, 87% and 81% in the dose dependent study, respectively), suggesting that in the cultivation with free nisin the modulation of nisin resistance is possibly performed through sigB and suggesting that defenses against oxidative stress may not have much contribution to nisin resistance. Regarding the differential gene expression between nanoencapsulated nisin and free nisin 100 mg/L, a extremely strong increase in the expression of ctsR, dnaA and virR (2,004%, 1,500% and 4,764%, respectively), a very strong increase in the expression of prfA and lmo1433 (583% and 234%, respectively) and a very strong reduction in expression of kat (32%), suggesting that in cultures with phosphatidylcholine signaling, the modulation of nisin resistance is possibly performed, in addition to sigB, by increasing the expression of viR, suggesting that possibly the microorganism is misinterpreting being in the host, increasing the expression of virulence factors through the prfA regulator and corroborating that possibly phosphatidylcholine is promoting the enrichment of the culture medium.