Diagnóstico molecular do vírus de hepatite C e de hepatite B em amostras fixadas em papel filtro

Abstract

Os vírus da hepatite C (HCV) e da hepatite B (HBV) estão associados à cirrose e carcinoma hepatocelular. Amostras de sangue fixadas em papel filtro (ou Dried Blood Spot, DBS) têm sido utilizadas em análises clínicas devido à facilidade no envio e armazenamento e ao menor desconforto do paciente à coleta. Os objetivos deste trabalho foram validar testes moleculares para detecção de HCV e HBV, avaliar o uso de DBS (903 Whatman) na detecção de ambos os vírus e determinar os genótipos de amostras HCV. A validação foi realizada utilizando amostras de plasma com resultados conhecidos para os vírus e a avaliação do DBS empregou, também, amostras de plasma pareadas. Após a extração dos ácidos nucléicos, foram executadas as técnicas in-house de Real Time PCR para detecção de HBV, RT-Real Time PCR para HCV e sequenciamento para a genotipagem de HCV. Na validação do teste para HCV, foram utilizadas 120 amostras, obtendo resultados de Kappa (Κ), acurácia, sensibilidade e especificidade de 100%. Na avaliação do teste para HCV, utilizando DBS, com 128 amostras, os resultados de Kappa, acurácia, sensibilidade, especificidade também foram de 100%. Em 51 amostras, foram identificados os genótipos 1 (57%), 2 (10%) e 3 (33%). A validação do teste para HBV, com 54 amostras, obteve Kappa de 81%; acurácia, 91%; sensibilidade, 86%; e especificidade, 96%. A avaliação do uso de DBS para HBV, com 64 amostras, obteve Kappa de 74%; acurácia, 88%; sensibilidade, 82%; e especificidade, 100%. Todos os valores de Kappa possuem p<0,001. Os resultados demonstram o potencial de utilização de DBS no diagnóstico molecular dos vírus das hepatites B e C.

The Hepatitis C virus (HCV) and the Hepatitis B virus (HBV) can develop to cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Samples from Dried Blood Spot (DBS) are used in clinical analysis, due to facilitated shipment and storage and to less discomfort fingerstick causes to patients. The aims of this work were to validate HCV and HBV’s molecular detection tests and evaluate the DBS (903 Whatman) use in both virus detection and determining HCV genotype. Validation was done using plasma samples with known results and for DBS evaluation paired plasma was also used. After nucleic acid extraction, in-house Real Time PCR assay to HBV detection, in-house RT-Real Time PCR assay to HCV detection, and inhouse RT-PCR and sequencing assays to HCV genotyping were performed. In HCV test validation, 120 samples were used, getting results for Kappa (Κ), accuracy, sensibility, specificity of 100%. In HCV test evaluation, using 128 samples, the results for Kappa, accuracy, sensibility, specificity were also 100%. Testing 51 HCV samples, genotype 1 (57%), genotype 2 (10%) and genotype 3 (33%) were identified. In HBV test validation, with 54 samples, we got Kappa, 81%; accuracy, 91%; sensibility. 86%; and specificity, 96%. In use of DBS for HBV evaluation, with 64 samples, we got Kappa, 74%; accuracy, 88%; sensibility, 82%; and specificity, 100%. All values of Kappa have p<0.001. Our results show the potential DBS use for HCV and HBV molecular diagnosis.