Viabilidade de blastocistos de Mus musculus domesticus expostos à alta pressão gasosa e submetidos à criopreservação

Abstract

A alta pressão gasosa (high gaseous pressure, HGP) tem sido descrita como um agente estressante capaz de induzir resposta ao estresse subletal, fornecendo proteção celular a estresses subsequentes, como a criopreservação, embora os mecanismos celulares envolvidos ainda não estejam elucidados. Este princípio foi investigado em blastocistos murinos expostos a diferentes tratamentos utilizando-se HGP, seguidos ou não de criopreservação. De um total de 427 fêmeas de Mus musculus domesticus superovuladas, 308 (72,1%) produziram 3070 blastocistos viáveis (média de 7,2 ± 11,5 blastocistos/fêmea superovulada e de 10,0 ± 12,5 blastocistos/fêmea responsiva ao tratamento superovulatório) que foram expostos a tratamentos de distintas pressões e tempos de exposição, em quatro grupos experimentais: (a) 20,7 MPa por 2 h (P20.T2); (b) 20,7 Mpa por 4 h (P20.T4); (c) 27,6 Mpa por 2 h (P27.T2); e (d) 34,5 Mpa por 2 h (P34.T2). Todos os grupos foram pareados com controles não expostos à HGP. No primeira parte do experimento, embriões foram expostos à HGP, conforme os grupos experimentais acima, e posteriormente submetidos ao cultivo in vitro por 72 h com o objetivo de verificar a influência dos protocolos de HGP sobre a taxa de eclosão. Não houve diferença nas taxas de eclosão e na morfologia entre os grupos experimentais e os controles. Já na segunda parte do experimento, os embriões foram expostos à HGP, conforme os grupos experimentais acima, e posteriormente criopreservados por curva de congelamento clássica (rápida). Após o descongelamento, os embriões foram cultivados in vitro por 72 h para a avaliação das taxas de eclosão entre os grupos. A taxa de eclosão do Grupo P34.T2 foi significativamente maior do que a dos controles criopreservados não expostos à HGP (70,2% vs. 58,6%, p < 0,05). Conclui-se que a HGP pode ser usada como agente estressor subletal sem perda da viabilidade embrionária, e que o uso da HGP de 34,5 MPa por 2 h prévio à criopreservação modificou positivamente a taxa de sobrevivência in vitro de blastocistos murinos criopreservados.

High gaseous pressure (HGP) has been reported as a sublethal stressor able to induce "sublethal stress response”, providing cell protection to subsequent stress, such as cryopreservation, although the involved cellular mechanisms are little understood. This principle was investigated on murine blastocysts exposed to different HGP treatments with and without subsequent cryopreservation. A total of 308 (72.1%) out of 427 superovulated Mus musculus domesticus females produced 3,070 viable blastocysts (7.2 ± 11.5 blastocysts/superovulated mouse and 10.0 ± 12.5 blastocysts/female responsive to superovulation) that were exposed to distinct pressure intensities and exposure times, according to four experimental groups: (a) 20.7 MPa for 2 h (P20.T2); (b) 20.7 MPa for 4 h (P20.T4); (c) 27.6 MPa for 2 h (P27.T2); and (d) 34.5 MPa for 2 h (P34.T2). All groups were compared with non-exposed HGP controls. In the first part of the experiment, embryos were exposed to HGP treatments, according to the experimental groups as above, and subsequently in vitro-cultured for 72 h aiming to compare the effects of the HGP protocols on subsequent hatching rates. No differences in hatching rates and morphology were observed between experimental and control groups. In the second parto of the experiment, embryos were exposed to HGP treatments, according to the experimental groups as above, and subsequently cryopreserved by rapid (classic) freezing. After thawing, embryos were in vitro-cultured for 72 h to compare hatching rates between groups. Hatching rates in the P34.5.T2 group were significantly higher than for the cryopreserved control embryos with no HGP treatment (70.2% vs. 58.6%, p < 0.05). Therefore, we conclude that HGP can be used as a stressor without compromising subsequent in vitro embryo viability, and the use of HGP at 34.5 MPa for 2 h prior to cryopreservation improved the in vitro survival of cryopreserved murine blastocysts compared with control counterparts.