Desenvolvimento e validação de qPQR para detecção de pectobactérias e Ralstonia solanacearum em tubérculos de batata

Abstract

Pectobactérias (Pectobacterium spp. e Dickeya spp.) são os agentes causais da canela-preta e podridão-mole, e Ralstonia solanacearum da murcha bacteriana. A principal fonte de inóculo dessas doenças é o tubérculo-semente assintomático. As importações brasileiras de tubérculo-semente podem representar um risco à cultura. Tubérculos-semente livres de patógenos é considerada a melhor estratégia para manejar essas doenças. Entrentanto, métodos sensíveis para detecção desses patógenos são necessários. Sendo assim, o principal objetivo dessa pesquisa foi desenvolver e validar um método para detecção de pectobactérias e R. solanacearum presentes em baixa densidade populacional em tubérculos de batata, através de qPCR. A qPCR foi realizada com sondas de hidrólise (sondas TaqMan® MGB) e fluoróforo intercalante de DNA fita-dupla (SYBR Green I). Esse método poderá ser utilizado como uma ferramenta em estudos epidemiológicos, programas de certificação e inspeção quarentenária. O uso de cartões FTA para a coleta e extração do DNA dos tubérculos foi testado, utilizando três métodos de transferência de amostras: pressão direta; cone triturado em PBS; e fragmentos retirados com seringa e triturados em PBS. O primeiro método foi o mais sensível, proporcionando um limite de detecção por PCR de 1x102 UFC.mL-1. Oligonucleotídeos iniciadores foram desenhados para as bactérias-alvo, exceto para R. solanacearum, na qual se usou os oligonucleotídeos iniciadores OLI1/Y2 em PCR e qPCR. Dickeya spp. (54,9%) e R. solanacearum (52,9%) apresentaram a maior incidência nas 206 amostras analisadas por qPCR, seguidas por P. brasiliensis (16,5%), P. atrosepticum (9,2%), P. carotovorum (6,3%) e P. betavasculorum (1,9%). Esta última trata-se do primeiro registro em batata no Brasil. Associações entre as espécies bacterianas nos tubérculos também foram verificadas, onde Dickeya spp. e R. solanacearum foram encontradas em associação (24,8%) nos tubérculos, mas estavam presentes isoladamente em 20,8 e 13,4%, respectivamente. Dentro desse contexto, a presença de uma população bacteriana heterogênea nos tecidos vasculares dos tubérculos foi demonstrada.

Pectobacteria (Pectobacterium spp. and Dickeya spp.) are the causal agent of blackleg and soft rot, and R. solanacearum of bacterial wilt, in potato crop. The main source of inocula is symptomless seed potato tuber. The Brazilian imports of seed potato may pose a risk to the crop. Pathogen-free seed is the best strategy to manage these diseases. Therefore high-sensitive methods for detection of these bacteria are mandatory. Thus, the main objective of this study was to develop and validate a method for detection of pectobacteria and R. solanacearum present in low population density in potato tubers, by qPCR (absolute quantification) in assay with hydrolysis probes (TaqMan® MGB probes) and double-stranded DNA binding dye (SYBR Green I). This method can be used as a tool in epidemiological studies, certification programs, and quarantine inspection. The use of FTA cards to collection, and DNA extraction was tested using three methods: direct pressure, cone crushed in PBS, and small pieces removed with syringe and crushed in PBS. The first method was the most sensitive, providing a limit of detection by PCR of 1x102 CFU.mL-1. Primers were designed for target bacterial species, except for R. solanacearum, in which was used OLI1/Y2 primers for PCR and qPCR. Dickeya spp. (54.9%) and R. solanacearum (52.9%) had the highest incidence in the 206 samples analyzed by qPCR, followed by P. brasiliensis (16.5%), P. atrosepticum (9.2%), P. carotovorum (6.3%) and P. betavasculorum (1.9%). The occurrence of P. betavasculorum in potato is the first record of potato in Brazil. Associations between bacterial species in the tubers were also found, where Dickeya spp. and R. solanacearum were found in association (24.8%) in the tubers, but were present alone in 20.8 and 13.4%, respectively. Within this context, the presence of a heterogeneous bacterial population in the vascular tissues of the tubers was demonstrated.