Identificação dos alvos celulares das proteínas de transdução de sinal PII do diazotrófico de vida livre Azospirillum amazonense

Abstract

A superfamília PII de proteínas de transdução de sinal é conhecida por conter as proteínas sinalizadoras mais amplamente distribuídas na natureza, sendo ubíquas entre bactérias. Elas desempenham um papel chave na coordenação da regulação de processos metabólicos centrais, especialmente aqueles relacionados ao metabolismo de nitrogênio. As proteínas PII atuam por interação direta com uma variedade de alvos celulares, tais como fatores transcricionais, enzimas e transportadores, resultando na modulação da atividade desses receptores. A sinalização realizada por PII apresenta o potencial de responder a três sinais metabólicos: o sinal de energia ATP, o sinal de carbono 2- oxoglutarato e o sinal de nitrogênio glutamina. Os dois primeiros são transmitidos diretamente pela ligação das moléculas efetoras, enquanto que os níveis de nitrogênio são refletidos pela uridilação reversível de PII pela enzima GlnD, em condições de deficiência de nitrogênio. Em microrganismos diazotróficos, o papel das proteínas PII é estendido para o controle do processo de fixação de nitrogênio. O gênero Azospirillum é composto de diazotróficos de vida livre capazes de se associar de forma benéfica com diversas gramíneas, como por exemplo, cana-de-açúcar e arroz. Com o objetivo de analisar os sistemas regulatórios do metabolismo e da fixação de nitrogênio no modelo de estudo Azospirillum amazonense, foi proposta uma investigação da função das proteínas PII nessas vias. Os alvos celulares dos parálogos de PII presentes em A. amazonense – chamados de GlnB e GlnK – foram investigados utilizando experimentos de pull-down. Dois extratos de A. amazonense foram testados, referindo-se a condições de crescimento em abundância e limitação de nitrogênio. Ao todo, 42 prováveis proteínas de interação das formas não modificadas das duas proteínas PII foram identificadas por espectrometria de massas em tandem, no entanto as interações mapeadas devem ser confirmadas por métodos alternativos. Entre as proteínas isoladas, destaca-se a presença de 10 fatores transcricionais. Esses podem representar pontos de conexão com outros sistemas regulatórios, tais como o sistema de controle do conteúdo celular de exopolissacarídeos e o sistema de controle redox de processos energéticos. Além desses reguladores, nossos resultados incluem 2 proteínas envolvidas no metabolismo de metais, 2 transportadores, 12 enzimas metabólicas, 7 proteínas de funções basais e 9 proteínas de função desconhecida.

The PII superfamily of signal transduction proteins is known to contain the most widely distributed signaling proteins in nature, being ubiquitous among bacteria. They play a major role in coordinating the regulation of central metabolic processes, especially those related to nitrogen metabolism. PII proteins act by direct interaction with a variety of cellular targets, such as transcription factors, enzymes and transporters, resulting in modulation of receptor activities. PII signaling has the potential to respond to three central metabolic signals: the energy signal ATP, the carbon signal 2- oxoglutarate and the nitrogen signal glutamine. The first two are sensed directly by the binding of the effector molecules. The nitrogen levels are reflected by reversible uridylation of the PII by the glutamine-sensor enzyme GlnD, under nitrogen deficiency conditions. Thus, PII proteins serve as the central processing unit for the integration of antagonistic signals of carbon and nitrogen status, and use this information to control nitrogen assimilation. In diazotrophic microorganisms, PII proteins role is extended to the control of the nitrogen fixation process. The genus Azospirillum is composed of free-living diazotrophs capable of beneficial association with a variety of Graminae plants, such as sugarcane and rice. In order to appraise the regulatory systems of nitrogen fixation and metabolism in the model organism Azospirillum amazonense, an investigation of the PII proteins functions in these networks was proposed. The cellular targets of each of the PII paralogues found in A. amazonense – named GlnB and GlnK – were investigated by pull-down assays. Two protein extracts of A. amazonense were tested, referring to growth conditions of nitrogen limitation and sufficiency. Altogether, 42 potential interacting partners of the unmodified form of the two PII proteins were identified by LC-MS/MS, and these interactions are to be further confirmed by alternative methods. It is noteworthy that 10 transcriptional factors were isolated in our experiments. These factors may represent linking points for the cross-talk between nitrogen regulation and other regulatory systems, such as the control of exopolysaccharide biosynthesis and the redox control of energetic processes. Besides these transcriptional regulators, our results comprise 2 proteins related to heavy metals metabolism, 2 transporters, 12 metabolic enzymes, 7 housekeeping function proteins and 9 unknown function proteins.