Desenvolvimento de biocatalisadores compostos por pectinases e celulases imobilizadas para a clarificação de sucos de frutas

Abstract

O consumo de sucos de frutas vem apresentando grande crescimento, acompanhando a tendência mundial de bebidas saudáveis. Entretanto, sua composição rica em polissacarídeos pode influenciar o rendimento produtivo, bem como sua qualidade. Desta forma, o presente trabalho buscou, por meio do desenvolvimento de biocatalisadores compostos por pectinases e celulases imobilizadas, melhorar a eficiência do processo produtivo de clarificação e a qualidade dos sucos de frutas. Primeiramente, no intuito de melhorar a separação e a reutilização das enzimas imobilizadas dos sedimentos dos sucos, duas metodologias de imobilização com partículas magnéticas foram testadas, CLEAs-magnéticos (CLEA-MP*) e a imobilização na superfície da partícula magnética ativada com glutaraldeído (Enz-Glu-MP*). No entanto, uma queda quase linear no rendimento durante os 8 ciclos de clarificação do suco de uva foi verificado em ambos biocatalisadores, podendo estar relacionado a menor atração magnética do CLEA-MP* que dificultou a separação deste do suco, ou então, a menor estabilidade do Enz-Glu-MP*. Em seguida, buscando preparar biocatalisadores com alta estabilidade, aliada a boas propriedades magnéticas, estudou-se diferentes metodologias de recobrimento das partículas magnéticas com quitosana, alcançando 3 diferentes biocatalisadores com distintos tamanhos: Nano (Nano-CMag), Micro (Micro-CMag) e Macro (Macro-CMag). O tamanho do biocatalisador influenciou diretamente nas características das enzimas imobilizadas, onde o Macro-CMag obteve as maiores estabilidades, apresentando as maiores atividades residuais após 25 ciclos de clarificação dos sucos de uva, maçã e laranja. A seguir, procurou-se entender como cada enzima reage as diferentes condições de pH, visto que muitos protocolos de imobilização exigem condições alcalinas, nas quais as enzimas apresentam baixa estabilidade. Desta forma, diferentes agentes estabilizantes foram testados, onde verificou-se que 20 % de polietilenoglicol (PEG) apresentou os melhores resultados de estabilização para todas as enzimas do preparado em pH 10 a 25 °C, mantendo atividades próximas a 100 %. Posteriormente, a imobilização de duas das principais enzimas para a hidrólise da pectina, pectina liase (PL) e poligalacturonase (PG), foram estudadas variando a condição de imobilização nos suportes glioxil-agarose, vinilsulfona-agarose, MANAE e MANAE-glutaraldeído. Para ambas as enzimas o melhor suporte foi MANAE-glutaraldeído. Os diferentes pHs estudados para a imobilização apresentaram efeitos na recuperação da atividade enzimática, estabilidade térmica e operacional, sugerindo que os diferentes pHs testados permitiram obter enzimas imobilizadas com distintas orientações. Além disso, altas atividades foram alcançadas em amostras que apresentaram uma condição de imobilização mais lenta (alta força iônica). Já os biocatalisadores que foram incubados a pH 8 na parte final da imobilização, apresentaram as maiores estabilidades térmicas e operacionais, devido a formação de ligações multipontuais enzima-suporte. Por fim, visto as melhores estabilidades e a fácil separação da reação apresentada pelas macroesferas de quitosana, estas foram preparadas e aplicadas em reatores de leito empacotado e leito fluidizado para a clarificação contínua do suco de laranja. Devido ao seu maior tamanho, as partículas magnéticas não foram necessárias para a separação do suporte e uma maior concentração de enzima pôde ser imobilizada. Os melhores resultados foram alcançados utilizando o reator de leito fluidizado, provavelmente devido à melhor difusão de massa desse sistema, enquanto que zonas mortas e caminhos preferenciais foram observados no reator de leito empacotado. A aplicação de enzimas imobilizadas em reatores contínuos apresentou-se como uma tecnologia promissora para a clarificação de sucos de frutas industriais, trazendo contribuições para a eficiência do processo produtivo e para o aumento da qualidade dos sucos de frutas.

The consumption of fruit juice has been growing, following the worldwide trend of consumption of healthy drinks. However, their rich composition in polysaccharides can influence the production yield, as well as their quality. Thus, this work sought to improve the efficiency of the clarification process and the fruit juices quality, through the development of biocatalysts composed of pectinases and cellulases immobilized. First, in order to improve the separation and reuse of the immobilized enzymes of the juice sediments, two immobilization methodologies with magnetic particles were tested, CLEAs-magnetic (CLEA-MP*) and immobilization on the magnetic particle surface activated with glutaraldehyde (Enz-Glu-MP*). However, a linear drop in yield during the 8 cycles of grape juice clarification was observed in both biocatalysts, which may be related to the lower magnetic attraction of the CLEA-MP * that made it difficult to separate from the juice, or then, the lower stability of the Enz-Glu-MP *. Then, seeking to prepare biocatalysts with high stability combined to good magnetic properties, different methodologies for covering the magnetic particles with chitosan were studied, obtaining 3 biocatalysts with different sizes: Nano (Nano-CMag), Micro (Micro-CMag) and Macro (Macro-CMag). The biocatalyst size influenced the immobilized enzymes characteristics, where the Macro-CMag achieved the greatest stability, presenting the higher residual activities after 25 cycles of grape, apple and orange juices clarification. Next, we sought to understand how each enzyme reacts to different pH conditions, since many immobilization protocols require alkaline conditions, in which the enzymes have low stability. In this way, different stabilizing agents were tested, where it was found that 20 % of polyethylene glycol (PEG) presented the best stabilization at pH 10 to 25 ° C, keeping activities close to 100 % for all enzymes. Subsequently, the immobilization of two of the main enzymes for the pectic polysaccharides hydrolysis, Pectin lyase (PL) and Polygalacturonase (PG), were studied, varying the immobilization condition on glyoxyl-agarose, vinylsulfone-agarose, MANAE and MANAE-glutaraldehyde supports. For both enzymes, the best support was MANAE-glutaraldehyde. The different pHs studied for the immobilization had effects on the enzyme recovered activity, thermal and operational stability, suggesting that the different pHs tested allowed to obtain immobilized enzymes with different orientations. In addition, high activities were achieved in samples that showed a slower immobilization condition (high ionic strength). Already the biocatalysts that were incubated at pH 8 in the final part of the immobilization, presented the higher thermal and operational stability, due to the formation of multipoint bonds between enzyme-support. Finally, in view the best stability and the easy separation of the reaction medium presented by the chitosan macrospheres, these were prepared and applied in packed-bed and fluidized-bed reactors for the continuous clarification of orange juice. Due to their larger size, the magnetic particles were not necessary for the biocatalyst separation of the reaction, so a higher enzyme concentration can be immobilized. The best results achieved by the fluidized-bed reactor may be related to the better mass diffusion of this system, whereas dead zones and preferential paths were observed in the packed-bed reactor. Immobilized enzymes application in continuous reactors is a promising technology for the industrial clarification of fruit juices, bringing contributions to the production process efficiency and to the improvement of the fruit juices quality.