Oscilações corticais e hipocampais interictais e o efeito do transplante de precursores gabaérgicos sobre atividade peri-ictal no modelo animal de epilepsia induzida por pilocarpina

Abstract

Epilepsias refratárias com esclerose hipocampal e modelos animais de epilepsia com anormalidades na formação hipocampal, são associados com reorganização sináptica e consequente alteração do padrão de conectividade neuronal e oscilações cerebrais. Análise quantitativa do eletroencefalograma tem sido cada vez mais aplicada para estudar alterações específicas em oscilações cerebrais na epilepsia. A maioria destes estudos focam em análises durante ou no início das crises epilépticas. Contudo, a conectividade neuronal é também notavelmente alterada durante os estágios inter e pós-ictais. Neste trabalho, exploramos as alterações nos ritmos cerebrais no período interictal livre de pontas epileptiformes (IES). Estas alterações em oscilações cerebrais em epilepsia têm uma relação importante com anormalidades dos neurônios GABAérgicos, incluindo interneurônios que expressam parvalbumina e somatostatina. Realmente, a perda destes interneurônios do hipocampo é observada em epilepsia e associada com a reorganização anormal da rede neural em epileptogênese e em atividade epileptógena. Uma vez que a liberação de GABA na área hipocampal é dramaticamente reduzida quando as crises epilépticas começam a ocorrer em modelo de epilepsia induzida por pilocarpina, nós analisamos a atividade da descarboxilase do ácido glutâmico (GAD) e quantificamos o conteúdo de GABA e glutamato por HPLC. Como anormalidades do sistema GABAérgico constituem uma alteração importante em muitos tipos de epilepsia, por muitos anos terapias de reposição celular foram desenvolvidas com o intuito de restaurar a inibição em diferentes modelos animais, como a epilepsia. Nos focamos em investigar como transplantes de células precursoras da eminência gangliônica medial (MGE) afetam a rede neural anormal e, consequentemente, as oscilações cerebrais para modificar a atividade das crises epilépticas além de restaurar a inibição. Para tanto, primeiro quantificamos o potencial de campo local (LFP) in vivo em eletrodos corticais (camadas IV-CTX1 e V-ctx2) e em CA1 hipocampais (camadas oriens-Ors, piramidal-Pyr, radiada-Rad e lacunosa-molecular-LM) em ratos 5 semanas após injeção de pilocarpina. Os animais que receberam pilocarpina mas não apresentaram status epilepticus (SE) compõem o grupo não-SE (NSE). Animais que tiveram SE e posteriormente desenvolveram crises epilépticas espontâneas e recorrentes (CER) (animais epilépticos) exibiram maior potência de delta no córtex e Ors, Rad e LM no hipocampo. Eles também apresentaram menor potência de teta no córtex, Ors e LM, menor potência de gama lento em CTx1, Ctx2 e Ors, e menos gama médio e rápido no Ors. Animais NSE tiveram maior potência de delta e menor gama lento somente no Ctx1, e menor potência do teta no córtex e LM. Fundamentalmente, animais epilépticos apresentaram maior coerência córtico-hipocampal na faixa delta entre Ctx1-Ors, Ctx2-Ors, Ctx2-Pyr, Pyr-Ors e acoplamento fase-amplitude (PAC) mais forte da fase delta com todas as frequências na Rad. Animais NSE também apresentaram maior coerência córtico-hipocampal na frequência delta entre Ctx1-Ors e Ctx2-Ors, mas não houve alteração no PAC, sugerindo que há nestes animais alguma reorganização cortical. Em segundo lugar, nós analisamos a atividade da enzima GAD e quantificamos GABA e glutamato por HPLC no período crônico, uma vez que o fluxo de GABA é dramaticamente alterado na área hipocampal no modelo de pilocarpina. Contudo, não foram encontradas diferenças entre os grupos analisados, controles, NSE e animais epilépticos. Em seguida, nós analisamos os efeitos das células derivadas da MGE transplantadas no hipocampo no modelo de epilepsia induzido por pilocarpina. Para isso, realizamos a análise quantitativa de registros peri-ictais in vivo em registros corticais e hipocampais de animais epilépticos que receberam (Pilo+MGE) ou não (Pilo) transplante intra-hipocampal de precursores da MGE. As análises foram realizadas no período crônico, três meses após o transplante. Os principais achados foram: 1) As células transplantadas migraram e se diferenciaram em interneurônios maduros no parênquima cerebral hospedeiro. 2) Animais Pilo+MGE reduziram o número de crises epilépticas. 3) Animais Pilo+MGE apresentaram menor potência de delta e teta no córtex e hipocampo que Pilo, no período 5min pré-ictal, e no córtex no 5min pós-ictal. 4) Animais Pilo+MGE, no córtex, apresentaram aumento da potência de gama rápido e ripples e diminuição do acoplamento delta-gama rápido e delta-ripples nos 20s comparando com 5min antes do início da crise epiléptica. Todas as oscilações corticais estavam reduzidas nos 20s comparadas com 5min pós-ictais nos animais Pilo+MGE. 5) Animais Pilo+MGE apresentaram maior coerência córtico-hipocampal nas faixas delta e teta comparado com Pilo no período 5min pré-ictal, e maior coerência delta nos 20s pós-ictais comparado com animais Pilo. 6) Animais Pilo+MGE tiveram acoplamento delta/teta-gama lento/médio mais fraco nos 20s comparando com 5min antes da crise epiléptica e acoplamento delta-gama baixo mais forte nos 20s após o fim da crise comparando com animais Pilo. No geral, nossos dados sugerem um aumento de sincronia entre o córtex e CA1 do hipocampo em animais epilépticos, particularmente na frequência delta, com um forte acoplamento em Rad, sendo esse provavelmente um importante sítio de sincronização. A quantidade de GABA e atividade da GAD não foram alteradas, sugerindo uma possível mudança adaptativa da neurotransmissão de GABA mesmo com um número reduzido de interneurônios. As células precursoras da MGE transplantadas possivelmente induzem uma reorganização da rede neural do hospedeiro que pode ser responsável pela redução de crises e pelas alterações no padrão oscilatório. Particularmente, a diminuição da potência de delta, aumento da coerência córtico-hipocampal de delta e teta interictal e redução do acoplamento delta-oscilações de alta frequência (HFOs) na área hipocampal podem ser considerados evidências de reorganização sináptica, com consequente redução da epileptogênese. O aumento de potência e diminuição da coerência das HFOs no início da crise epiléptica são provavelmente relacionados com a integração e aumento da inibição induzida pelo transplante. Entender a organização dos ritmos cerebrais em períodos não ictais e o papel dos novos interneurônios na reorganização da rede pode nos ajudar a revelar os mecanismos por trás do controle das crises epilépticas recorrentes (CER), que claramente está além de um simples aumento da inibição.

Refractory epilepsies related to hippocampal sclerosis and animal models of epilepsy with abnormalities in the hippocampal formation are associated with synaptic reorganization and consequent altered pattern of neuronal connectivity and brain oscillations. Quantitative electroencephalogram analysis has been increasingly applied to study fine changes in brain oscillations in epilepsy. The majority of these studies have focused on brain synchrony either during or just before the seizure onset. However, neural connectivity is also notably altered during interictal and post-ictal states. In this work, we wanted to explore the changes in brain oscillations during interictal stages free of interictal epileptiform spikes (IES). These changes in brain oscillations in epilepsy are closed related to abnormalities of GABAergic neurons, including parvalbumin and somatostatin-expressing interneurons. Indeed, loss of these interneurons in the hippocampus has been found in epilepsy associated with the abnormal rewiring of the network, epileptogenesis and epileptiform activity. Since GABA release is shown to be dramatically reduced when spontaneous seizures begin to occur in hippocampal area in pilocarpine model of epilepsy, we analyzed the activity of glutamic acid decarboxylase (GAD) and quantified GABA and glutamate content by HPLC. As the GABAergic system is altered in many types of epilepsies, for many years cell replacement therapies have been developed in order to restore inhibition in different type of disease-based models, such as epilepsy, by grafting interneuronal precursor cells. We aimed to investigate how grafts of cells derived from the medial ganglionic eminence (MGE) affect the abnormal neuronal network, and consequently brain oscillations to modify seizure activity besides restoring inhibition. Therefore, first, we performed the quantitative analysis of the in vivo local field potential (LFP) from cortical layers IV to V (electrodes: Ctx1, Ctx2) and hippocampal CA1 areas (stratum oriens-Ors, pyramidale-Pyr, radiatum-Rad and lacunosum-moleculare-LM) in rats about 5 weeks after pilocarpine injection. Animals that received pilocarpine injection but did not develop status epilepticus (SE) are the non-SE (NSE) group. Animals that had SE and later spontaneous recurrent seizures (SRS) (epileptic animals) exhibited higher delta power recorded in cortical and hippocampal Ors, Rad and LM electrodes. They also had lower power of theta in cortical and hippocampal Ors and LM, lower slow gamma in Ctx1, Ctx2 and Ors, and lower middle and fast gamma power in Ors. NSE animals had higher delta and lower slow gamma power in Ctx1 only, and lower theta power in Ctx1, Ctx2 and LM. Essentially, epileptic animals had higher delta coherence between cortex and hippocampus such as, Ctx1-Ors, Ctx2-Ors, Ctx2-Pyr, Pyr-Ors and stronger phase-amplitude coupling (PAC) between delta and all frequencies in Rad. NSE animals also had higher delta coherence between Ctx1-Ors and Ctx2-Ors with no changes in PAC, suggesting some cortical network reorganization. Second, we analyzed the activity of GAD enzyme, and quantified GABA and glutamate by HPLC at the chronic period, since GABA outflow is dramatically changed in hippocampal area in the pilocarpine model of epilepsy. However, we could not find differences between all analyzed groups: controls, NSE and epileptic animals. Next, we analyzed the effect of MGE-derived cells grafted in the hippocampus of pilocarpine model of epilepsy. For that, we performed a quantitative analysis of the in vivo peri-ictal recordings from cortical and hippocampal areas of epileptic animals who had received (Pilo+MGE) or not (Pilo) intrahippocampal MGE-derived cells transplants. The analyses were done at the chronic period, three months after transplantation. The main findings are: 1) Grafted cells migrated and differentiated in mature interneurons in the host brain parenchyma. 2) Pilo+MGE animals had reduced number of seizures. 3) Pilo+MGE animals had lower delta e theta power in the cortex and hippocampus than Pilo, at the 5min pre-ictal period, and in cortical area at the 5min post-ictal period. 4) Pilo+MGE animals in the cortical areas had increased fast gamma and ripples power and decreased delta-fast gamma and delta-ripples phase-amplitude coupling (PAC) at 20s when compared to 5 min before seizure onset. All cortical oscillations were reduced at 20s when compared to 5min post-ictal period of Pilo+MGE animals. 5) Pilo+MGE animals had more cortico-hippocampal coherence in delta and theta bands when compared to Pilo animals at the 5min pre-ictal period, and more delta coherence at 20s post-ictal period when compared to Pilo animals. 6) Pilo+MGE animals had weaker delta/theta–slow/middle gamma PAC at 20s compared with 5min before seizure onset and stronger delta-slow-gamma PAC at 20s compared with Pilo animals after seizure termination. Overall, our data suggest an increased synchrony in cortex and CA1 hippocampal area of epileptic animals, particularly for delta frequency with intense delta coupling in Rad, probably an important synchronization site. GABA release/ content and GAD activity was not changed, suggesting a possible adaptive change in GABA neurotransmission even with the decreased number of interneurons. The grafted MGE-derived cells possibly induced a neuronal network reorganization in the host brain that could be responsible for seizure reduction and alterations in brain oscillation pattern. Particularly, the decrease in delta power, increase in the interictal coherence in delta and theta band and the reduction in delta-high frequency oscillations (HFOs) coupling in the hippocampal area could be considered as indicators of network rewiring, with consequent reduction of epileptogenesis. The increased power and decreased coherence of HFOs at the seizure onset were probably induced by integration of new interneurons and increased inhibition induced by transplantation. Understanding the rhythms organization at non-ictal state and the role of the new interneurons on the reorganized network could help us to unveil the mechanisms behind seizure control that clearly go beyond a simple increase in inhibition.