Estudos epigenéticos em Drosophila : uma análise evolutiva multinível da enigmática enzima DNMT2

Abstract

Fundamentalmente, o processo epigenético caracteriza-se por contribuir com diferentes fenótipos alternativos emergindo em um organismo a partir de seu genótipo. Os mecanismos envolvidos na modulação da expressão dos genes são amplamente estudados, especialmente em vertebrados (mamíferos). Podemos dividir esses mecanismos epigenéticos de três formas: (i) modificação de citosinas genômicas; (ii) modificação pós-tranducional das caudas de histonas; e (iii) controle de transcritos mediados por RNAs não-codificantes. Desses três mecanismos descritos, a modificação de citosinas genômicas por meio da metilação é a mais bem estudada. Apesar do amplo conhecimento que se estabeleceu sobre as funções e impactos da metilação em mamíferos nos aspectos fisiológicos e ontogenéticos, em invertebrados ainda residem diversas questões a serem elucidadas. Como Drosophila possui apenas a DNA metiltransferase 2 (Dnmt2), é reconhecida como organismo “Dnmt2-only”. Os padrões de metilação de citosinas nesse grupo de organismos possui destacadas diferenças em relação aos demais organismos que possuem as DNA metiltransferases canônicas (Dnmt1 e Dnmt3). Assim, a presente tese apresenta em um primeiro momento, extensivo estudo sobre a conservação e evolução da Dnmt2 em drosofilídeos. Para isso, utilizamos aproximadamente 70 espécies de Drosophilidae. Como resultado das análises filogenéticas, os principais clados de Drosophilidae foram recuperados, onde observamos claramente as relações evolutivas entre o subgênero Drosophila e Sophophora e suas espécies. Analisamos quais as forças evolutivas conduziram a história da Dnmt2 dentro do gênero Drosophila e observamos que em Dnmt2 de drosofilídeos há forte ação de seleção purificadora. Entretanto, seis sítios apresentaram sinais de seleção positiva e doze outros sítios, seleção positiva desbalanceadora - favorecendo mudanças estruturais e funcionais na enzima Dnmt2. Destacamos a alta taxa de substituição nucleotídica por códon no clado das espécies do subgrupo willistoni. Além disso, aprofundamos os estudos sobre os aspectos evolutivos dentro do contexto epigenético, analisando possíveis proteínas que interajam, direta ou indiretamente, com a Dnmt2. Ao todo, quinze proteínas compartilham significativa taxa de covariação evolutiva com Dnmt2, sugerindo serem potenciais parceiras em diferentes redes de controle de expressão gênica. A relevância de um gene pode ser aferida, entre diversas formas, por seu padrão de expressão ao longo da ontogenia do organismo. Como D. willistoni se destaca por suas peculiaridades no âmbito epigenético, em um segundo momento, procuramos analisar os 12 padrões dos níveis transcricionais e localizar o gene Dnmt2 através de hibridação in situ em cromossomos politênicos. Verificamos que o gene Dnmt2 de D. willistoni possui maior nível transcricional nos estágios iniciais, diminuindo o com o avançar do desenvolvimento. Interessantemente, os dados obtidos por qPCR em adultos de D. willistoni, sugerem que esses possuem níveis de expressão levemente maiores do que aqueles observados em estudos prévios com D. melanogaster. Também detectamos transcritos de Dnmt2 já no período da oogênese, o que pode ser um indicativo que esse seja de origem materna. O gene Dnmt2 se encontra em região subtelomérica do braço IIL (Elemento B de Muller, comprovando sintenia cromossômica com outras 12 espécies de Drosophila). A localização de Dnmt2 é por si só interessante, pois genes localizados em regiões próximas aos telômeros (e centrômeros) possuem características evolutivas marcadamente distintas das demais regiões cromossômicas, o que pode estar relacionado com as diferenças quanto aos aspectos evolutivos moleculares descritos previamente em D. willistoni. Por fim, nas duas últimas etapas analisamos as propriedades físico-químicas emergentes da estrutura terciária de diversas Dnmt2, com especial atenção à região responsável pelo reconhecimento da sequência alvo a ser metilada (TRD). Utilizamos para esse estudo as Dnmt2 de procariotos HhaI e HaeIII, do gênero Haemophilus (reconhecidas por serem DNA metiltransferases), a Dnmt2 de Geobacter sulfurreducens, de Entamoeba histolytica, de Spodoptera frugiperda e humana (todas com afinidade por tRNA) e vinte e seis modelos gerados por meio de modelagem molecular por homologia estrutural de drosofilídeos. Constatamos que mutações em sítios da TRD modificam o perfil de distribuição de cargas eletrostáticas de superfície (CES) e, consequentemente, a atividade cinética da enzima junto ao substrato. Observamos que mesmo entre espécies próximas (drosofilídeos), as CES são diferentes. D. willistoni apresenta características em seu perfil de CES que a diferencia das demais espécies de Drosophila e a aproxima dos valores de cinética enzimática encontrados experimentalmente em HhaI. Através de simulações de dinâmica molecular do complexo Dnmt2-DNA de HhaI, E. histolytica, S. frugiperda, D. melanogaster, D. willistoni e Dnmt2 humana, constatamos que as diferenças encontradas nas CES das TRDs refletem diretamente mudanças nas dinâmicas entre enzima e ligante. A Dnmt2 de D. willistoni é a enzima eucariótica que apresentou o maior número de ligações de Hidrogênio estáveis com DNA, comportamento similar ao encontrado no complexo HhaI-DNA, reconhecidamente uma DNA metiltransferase.

Fundamentally, the epigenetic process is characterized by contributing with alternative phenotypes emerging in an organism from its genotype. The mechanisms involved in modulating gene expression are extensively studied, especially in vertebrates (mammals). We can divide these epigenetic mechanisms in three ways: (i) modification of genomic cytosines; (ii) histone tails post-translational modification; and (iii) control of transcripts mediated by non-coding RNAs. Of these three mechanisms described, the modification of genomic cytosines through methylation is the most well studied. In spite of the wide knowledge that has been established on the functions and impacts of the methylation in mammals in the physiological and ontogenetic aspects, in invertebrates there still remain several questions to be elucidated. As Drosophila has only DNA methyltransferase 2 (Dnmt2), it is recognized as "Dnmt2-only" organisms. The methylation patterns of cytosines in this group of organisms have remarkable differences in relation to the other organisms that have the canonical DNA methyltransferases (Dnmt1 and Dnmt3). Thus, the present thesis presents at first, an extensive study on the conservation and evolution of Dnmt2 in drosophilids. For this, we use approximately 70 species of Drosophilidae. As a result of the phylogenetic analyzes, the main clades of Drosophilidae were recovered, where we clearly observe the evolutionary relationships between the subgenus Drosophila and Sophophora and their species. We analyzed which evolutionary forces led to the history of Dnmt2 within the genus Drosophila and we observed that in drosophilids Dnmt2 there is a strong action of purifying selection. However, six sites showed positive selection signs and twelve other sites, positive-destabilizing selection - favoring structural and functional changes in the enzyme Dnmt2. We highlight the high rate of nucleotide substitution per codon in the clade of the species of the subgroup willistoni. In addition, we study the evolutionary aspects within the epigenetic context, analyzing possible proteins that interact, directly or indirectly, with Dnmt2. In all, fifteen proteins share a significant evolutionary rate covariation with Dnmt2, suggesting to be potential partners in different networks of control of gene expression. The relevance of a gene can be measured, among its various forms, by its pattern of expression throughout the organism ontogeny. As D. willistoni stands out for its peculiarities in the epigenetic scope, in this second moment, we try to analyze the 14 transcriptional levels and localization of the Dnmt2 gene through in situ hybridization in polytene chromosomes. We verified that the D. willistoni Dnmt2 has a higher transcriptional level in the initial stages, decreasing with the development progress. Interestingly, the data obtained by qPCR in adults of D. willistoni suggest that they have levels of expression slightly higher than those observed in previous studies with D. melanogaster. We also detected Dnmt2 transcripts already in the oogenesis period, which may be indicative of maternal origin. The Dnmt2 is found in the subtelomeric region of the arm IIL (Muller B Element, confirming chromosomal syntenia with 12 other Drosophila species). The localization of Dnmt2 is interesting in itself, because genes located in regions close to telomeres (and centromers) have markedly different evolutionary characteristics than the other chromosomal regions, which may be related to the differences in molecular evolution aspects previously described in D. willistoni. Finally, in the last two steps we analyzed the emerging physicochemical properties of the tertiary structure of several Dnmt2, with special attention to the region responsible for the recognition of the target sequence to be methylated (TRD). We used the prokaryotes Dnmt2 HhaI and HaeIII of the genus Haemophilus (recognized as DNA methyltransferases), the Geobacter sulfurreducens, Entamoeba histolytica, Spodoptera frugiperda and human (all with tRNA affinity) Dnmt2 and twenty-six drosophilids models generated by molecular homology modeling. We found that site mutations in the TRD modify the electrostatic surface charge distribution profile (ESCD) and, consequently, the enzymatic kinetics with the substrate. We observed that even among nearby species (drosophilids), ESCD are different. D. willistoni presents characteristics in its ESCD profile that differentiates it from the other Drosophila species and approximate the values of enzymatic kinetics found experimentally in HhaI. Through molecular dynamics simulations of the HhaI, E. histolytica, S. frugiperda, D. melanogaster, D. willistoni and human Dnmt2, we found that the differences in the ESCD of the TRDs directly reflect changes in the dynamics between enzyme and ligand. D. willistoni Dnmt2 is the eukaryotic enzyme that showed the highest number of hydrogen bonds with DNA, a behavior similar to that found in the complex HhaI-DNA, known as DNA methyltransferase.