Caracterização bioquímica de um protocolo de dissociação celular cerebral em peixe-zebra adulto para respirometria de alta resolucão

Abstract

A mitocôndria é a principal organela responsável pela biossíntese de ATP nas células eucariontes por meio da fosforilação oxidativa. Esse processo é essencial para a manutenção da vida e alterações nessa via podem estar relacionadas a múltiplas disfunções. Atualmente, é possível medir o consumo celular de 𝑂2 e inferir o estado da fosforilação oxidativa por meio da técnica de respirometria de alta resolução. Apesar dos avanços na área, refinamentos nos protocolos, principalmente em ensaios que determinam a função mitocondrial utilizando células intactas, são necessários. Neste contexto, nosso objetivo foi caracterizar um método de dissociação tecidual de cérebro de peixes-zebra adulto, visando obter um dissociado com o maior número de células viáveis para uso na respirometria de alta resolução, bem como aplicá-lo frente a uma patologia, como a epilepsia. Foram utilizados 272 peixes-zebra adultos (5-6 meses de idade) na proporção de 50:50 machos:fêmeas (CEUA 33922). Os animais foram mortos e seus cérebros retirados. As amostras foram submetidas a quatro diferentes dissociações teciduais: dissociação mecânica com pasteur de vidro; dissociação mecânica com pistilo para eppendorf; dissociação enzimática com collagenase IV; e dissociação enzimática com tripsina. A viabilidade celular foi avaliada pela incorporação de azul de Tripan e pela atividade extracelular da enzima lactato desidrogenase (LDH). A respirometria de alta resolução foi realizada no equipamento Oroboros Oxygraph-2k através da medida do consumo de oxigênio por meio da adição de inibidores da cadeia transportadora de elétrons e titulação com desacoplador do potencial de membrana mitocondrial. A viabilidade celular medida pelo do método de azul de Tripan não apresentou diferença significativa para as dissociações mecânicas com pasteur de vidro e pistilo, porém o grupo homogeneizado com pasteur de vidro apresentou menor variabilidade nos dados. Através da avaliação da viabilidade celular dos diferentes protocolos de dissociação tecidual por método enzimático, as concentrações ótimas escolhidas para dissociação com collagenase IV e tripsina foram respectivamente, 0,1mg/mL e 0,01%; ambas com 10 minutos de incubação em banho-maria a 37º C. A avaliação da viabilidade celular através da atividade da enzima LDH não apresentou diferenças significativas entre os grupos testados. Com base nesses dados, utilizamos as dissociações mecânica com pasteur de vidro, collagenase IV ou tripsina para avaliar diversos parâmetros da função mitocondrial em células intactas. As dissociações enzimáticas apresentaram redução significativa na respiração de rotina (ROUTINE), na capacidade de fosforilação oxidativa (P/O2) e na respiração extramitocondrial (ROX) quando comparadas a dissociação com pasteur de vidro. Desta forma, escolhemos o método de dissociação mecânica como padrão para testar os parâmetros de respiração celular frente a um modelo de crises epilépticas prolongadas induzidas por ácido caínico. Um aumento significativo na capacidade respiratória de reserva (SRC) foi observado nos animais submetidos a crises epilépticas prolongadas quando comparados ao grupo controle. Como conclusão, de acordo com os resultados obtidos nesse trabalho, sugerimos que a avaliação da função mitocondrial em peixe-zebra adulto seja feita através do protocolo de dissociação mecânica com pasteur de vidro.

Mitochondria are the main source of ATP biosynthesis in eukaryotic cells through oxidative phosphorylation. This process is essential for life maintenance and any changes in this pathway may be related to multiple dysfunctions and neurological diseases. It is now possible to measure cellular consumption of O2 and, consequently, evaluate oxidative phosphorylation capacity by High Resolution Respirometry technique. Despite the advances, in order to generate reliable and reproducible results, optimization of the metodology used to obtain samples for high resolution respirometry are required, especially in assays that determine mitochondrial function using intact cell. The main goal of the present work was to characterize a method to dissociate adult zebrafish brain tissue into viable single cells to high resolution respirometry measurements, as well as apply these optimized protocol under pathological states, such as epilepsy (CEUA 33922). Subjects were 272 animals (~50:50 male: female ratio) adult zebrafish (Danio rerio) (5-6 months-old). Animals were dissected and brain samples were submitted to four different tissue dissociations: mechanical dissociation with glass pasteur pipette: mechanical dissociation with microtube pestle; enzymatic dissociation with collagenase IV; and enzymatic dissociation with trypsin-EDTA. Cell viability was assessed by trypan blue exclusion test and extracellular activity of lactate dehydrogenase (LDH). High resolution respirometry was performed at Oroboros Oxygraph-2k equipment by measuring oxygen consumption after the addition of electron transport chain inhibitors and titration with mitochondrial uncoupler. The results of cellular viability by trypan blue assay did not show significant difference between the two mechanical dissociations compared, but the group homogenized with glass pasteur pipette present less variability. The optimal concentrations selected for dissociation with collagenase IV and trypsin were, respectively, 0.1 mg / mL and 0.01%, both incubated during 10 minutes at 37ºC. Cellular viability by LDH activity did not present significant differences. Based on these data, we evaluate mitochondrial function in intact cells originating from mechanical dissociation with glass pasteur pipette and enzymatic dissociation with collagenase IV or trypsin. Enzymatic dissociations showed a significant reduction in some parameters measured: routine respiration (ROUTINE), oxidative phosphorylation capacity (P/O2) and extramitochondrial respiration (ROX). Then, mechanical dissociation method was applied to measure respiratory capacity under prolonged epileptic seizures, and a significant increase in respiratory reserve capacity (SRC) was seen in epileptic group when compared to the control group. Concluding, both the mechanical dissociation with glass pasteur pippete and enzymatic dissociation with collagenase IV can be used to evaluate mitochondrial function.