Caracterização do papel da enzima de reparo de DNA, Aquiladenina DNA Glicosilase (AAG), na regulação da resposta ao estresse no retículo endoplasmático

Abstract

O genoma é um repositório dinâmico de informações genéticas e está constantemente exposto a agentes endógenos e exógenos. Para manter a fidelidade das informações armazenadas, várias vias de reparo evoluíram, como por exemplo o reparo por excisão de bases (BER), evoluíram. A principal glicosilase do BER, responsável por reparar danos no DNA oriundos de agentes alquilantes, é a alquiladenina DNA glicosilase (AAG). O reparo iniciado pela AAG pode levar ao acúmulo de intermediários citotóxicos. Para investigar os desfechos celulares frente ao dano alquilante, comparou-se a expressão gênica em camundongos deficientes ou proficientes em Aag, em resposta ao tratamento com o agente alquilante metil metano sulfonato (MMS). Na análise de redes transcricionais associadas à exposição MMS, identificou-se a expressão dependente de Aag de transcritos relacionados a resposta a proteínas mal dobradas (unfolded protein response, UPR). Neste trabalho, relatamos o envolvimento da AAG na elicitação do UPR, um mecanismo desencadeado no retículo endoplasmático (RE) para restaurar a proteostase celular, cuja disfunção está implicada em doenças como diabetes, Alzheimer e câncer. A AAG também inicia o BER para danos induzidos por temozolomida (TMZ), sendo fundamental para as respostas celulares à alquilação que afetam a sobrevida dos pacientes com glioblastoma (GBM). Para explorar o mecanismo subjacente à ativação de UPR induzida por dano alquilante, foram utilizadas linhagens celulares de GBM expressando diferentes níveis de AAG. Observou-se que MMS ativa o UPR em células de GBM, e esta resposta é diminuída na ausência de AAG. AAG é necessária para a ativação de UPR em múltiplos ramos, como evidenciado pela indução da expressão da chaperona BiP pelo agente alquilante e pela ativação do fator de transcrição XBP1, ambas suprimidas em células silenciadas para AAG. Além disso, o UPR mediado por AAG influencia a sobrevivência celular após dano alquilante e indução farmacológica de estresse no RE. O tratamento combinado de salinomicina (SLN), um indutor de estresse de RE, com TMZ resultou na ativação de UPR e citotoxicidade elevada em células proficientes em AAG, enquanto as células deficientes em AAG apresentaram resistência e ativação de UPR reduzida, nas mesmas condições. Para investigar o impacto da modulação dos níveis de AAG e UPR em pacientes com GBM, também realizou-se uma análise de sobrevida através de gráficos de Kaplan-Meier e do modelo de regressão de Cox. Pacientes com alta expressão de AAG e UPR, apresentaram pior sobrevida após tratamento com agente alquilante. Embora mais experimentos sejam necessários para caracterizar a natureza da contribuição da AAG para o UPR, demonstrou-se a existência de uma intercomunicação entre a resposta de reparo de DNA e as vias de resposta ao estresse do RE, que pode ser potencialmente relevante em um cenário clínico. É importante ressaltar que estes resultados sugerem uma justificativa para uma nova estratégia terapêutica no tratamento do câncer, combinando agentes alquilantes aos ativadores farmacológicos da UPR. Em conjunto, esses achados revelam um novo papel para o AAG coordenando as respostas celulares aos danos induzidos por agentes alquilantes.

The genome is a dynamic store of genetic information and is constantly threatened by endogenous and exogenous agents. To maintain fidelity of the information stored, several repair pathways, such as the Base Excision Repair (BER), have evolved. The main BER glycosylase responsible for repairing alkylation DNA damage is the alkyladenine DNA glycosylase (AAG). Repair initiated by AAG can lead to accumulation of cytotoxic intermediates. To investigate cellular outcomes to alkylation damage, gene expression was compared in mice deficient or proficient in Aag, in response to treatment with the alkylating agent methyl methane sulfonate (MMS). Analysis of transcriptional networks associated with MMS exposure identified an Aag-dependent expression of unfolded protein response (UPR). In this work, we report the involvement of AAG in the elicitation of the UPR, a mechanism triggered in the endoplasmic reticulum (ER) to restore proteostasis in the cell whose dysfunction is implicated in diseases like diabetes, Alzheimer’s disease and cancer. AAG initiates BER for temozolomide (TMZ)-induced base damage and is pivotal to the cellular responses of alkylation affecting glioblastoma (GBM) patients overall survival. In order to explore the mechanism underpinning alkylation-induced UPR activation, GBM cell lines expressing different AAG levels were used. MMS triggers the UPR in GBM cells, that is greatly diminished in the absence of AAG. AAG is required for UPR activation on multiple branches as evidenced by the fact that alkylation-induced expression of the chaperone BiP and activation of the transcription factor XBP1, both suppressed in AAG knock down cells. In addition, AAG-mediated UPR influences cell survival upon alkylation and ER stress pharmacological induction. Combination of salinomycin (SLN), an ER stress inducer, and TMZ treatment resulted in UPR activation and increased cytotoxicity in AAG proficient cells, while AAG-deficient cells were resistant and showed impaired UPR activation in the same conditions. To investigate the impact of AAG modulation of UPR in glioblastoma patients we also conducted a survival analyses through Kaplan-Meier plots and Cox regression model. Patients bearing high expression of AAG and UPR genes had a significant worse survival after treatment with alkylating agent. Whereas more experiments are required to characterize the nature of AAG’s contribution to the UPR, we demonstrate the existence of crosstalk between the DNA repair response and the ER stress response pathways, that is potentially relevant in a clinical setting. Importantly, our results suggest a rationale for a novel cancer therapeutic strategy combining alkylating agents to pharmacological activators of the UPR. Taken together, these findings uncover a new role for AAG coordinating cellular responses to alkylation-induced damage.