Caracterização funcional de And1 como potencial componente da via de sinalização de Ca2+/calcineurina em Cryptococcus neoformans

Abstract

Cryptococcus neoformans é um patógeno oportunista, principal causa de infecções fúngicas que acomentem pacientes imunocomprometidos. Esta levedura é capaz de colonizar o pulmão, disseminando-se para o tecido cerebral e causando um quadro de meningoencefalite criptococócica, frequentemente fatal. A sobrevivência de C. neoformans no hospedeiro é dependente do desenvolvimento de determinantes de virulência como crescimento a 37 °C, produção de cápsula polissacarídica e a produção de enzimas como urease e fosfolipase B1. Íons cálcio (Ca2+) são mensageiros intracelulares que participam da via de sinalização mediada por calcineurina, a qual é fundamental para a patogenicidade de C. neoformans. Transportadores vacuolares de Ca2+, como Pmc1, coordenam a regulação dos níveis de Ca2+ intracelulares. Foi demonstrado que Pmc1 é necessário para a virulência desta levedura, uma vez que linhagens contendo a deleção do gene PMC1 (pmc1Δ) foram avirulentas em modelo murino de infecção. Dados transcricionais prévios indicam que deleção de PMC1 desencadeia alterações na expressão de genes associados com mecanismos de disseminação cerebral e genes envolvidos com a via da calcineurina. No intuito de identificar possíveis reguladores ou alvos de calcineurina, genes cuja expressão é modulada pela deleção de PMC1 foram selecionados. A seleção foi restrita apenas à proteínas que continham assinatura de proteínas ligadoras de DNA. Análises por RT-qPCR demonstraram que o gene CNAG_03913 apresenta níveis de expressão significativamente aumentados em pmc1Δ na presença de FK506, sugerindo o envolvimento deste gene na via de sinalização de Ca2+/calcineurina. Análises in silico revelaram a presença do domínio AN1-like zinc finger, sendo então o referido gene denominado AND1 (AN1-like zinc finger containing domain). Para caracterizar funcionalmente o papel do gene AND1 na regulação da homeostase de Ca2+ em C. neoformans, linhagens mutante (and1Δ) e complementada (and1::AND1) foram construídas. Análises fenotípicas das linhagens mutantes indicaram possíveis alterações na parede celular. Células contendo a deleção de AND1 foram hipersensíveis ao crescimento em estresse de parede (Congo red) sob choque hiposmótico (meio YPD 0,5X), sugerindo uma relação com vias de manutenção da osmolaridade em C. neoformans. Além disto, análises de RT-qPCR indicaram diferenças significativas na expressão de genes codificadores de quitina sintases CHS3, CHS5 e CHS8, quitinase CHI22 e de PKC1 no mutante and1Δ, os quais podem ser correlacionados ao fenótipo de hipersensibilidade ao VIII agente estressor de parede celular Congo red. Estes dados sugerem um possível envolvimento de And1 com a regulação da parede celular de C. neoformans.

Cryptococcus neoformans is an opportunistic pathogen and the main cause of fungal infections related to death in immunocompromised patients. This yeast is able to disseminate from the lungs to the central nervous system, resulting in often fatal cryptococcal meningoencephalitis. The cryptococcal survival within the host requires a range of virulence determinants, such as growth at 37°C, development of a polysaccharide capsule and production of enzymes as urease and phospholipase B1. The cations calcium (Ca2+) are cellular messengers that participates in calcineurin signaling, which is fundamental to cryptococcal virulence. Moreover, vacuolar Ca2+ transporters such as Pmc1, coordinate the regulation of Ca2+ intracellular levels. It has been shown that Pmc1 is required for proper virulence of C. neoformans since the mutant strain lacking the PMC1 gene (pmc1Δ) was avirulent in mice infection model. Previous transcriptome data indicate that the disruption of PMC1 gene leads to alterations in the expression level of genes involved with cerebral dissemination and genes that participate of the calcineurin signaling pathway. Aiming to identify possible calcineurin regulators or targets, genes whose expression is modulated by the absence of PMC, were selected. Besides, this selection was limited to proteins containing signatures of DNA binding-proteins. RT-qPCR analysis revealed that the CNAG_03913 gene is highly expressed on pmc1Δ in the presence of FK506, suggesting a participation in the Ca2+/calcineurin signaling pathway. In silico analysis revealed the presence of AN1-like zinc finger domain, thus this gene was named AND1 (AN1-like zinc finger containing domain). To functionally characterize the role of AND1 gene in C. neoformans calcium homeostasis, a null mutant strain (and1Δ) and a complemented strain (and1::AND1) were constructed. Phenotypic analysis of the mutant strains indicated alterations in the yeast’s cell wall. Cells lacking AND1 were hypersensitive of cell wall stress (Congo red) upon hypoosmotic shock (YPD 0.5X), which then suggest a crosstalk with osmolarity maintenance pathways in C. neoformans. Moreover, RT-qPCR analysis demonstrated significative differences on the gene expression of genes that codes to chitin synthases CHS3, CHS5 and CHS8, CHI22 chitinase and PKC1 genes in the mutant and1Δ, which could be related to the hypersensibility to the cell wall stressor agent Congo red. In this way, the data suggests a possible involvement of And1 with the cell wall maintenance regulation.