Identificação e caracterização de genes que codificam ferroportinas em plantas de arroz (Oriza sativa L.)

Abstract

Estudos envolvendo a homeostase de nutrientes minerais essenciais em plantas são muito importantes, pois sem eles as plantas são incapazes de completar o seu ciclo de vida. Esses nutrientes minerais são obtidos principalmente a partir do solo e suas concentrações devem ser finamente reguladas. Em arroz, esses estudos são ainda mais importantes devido ao valor econômico e nutricional desta planta. Sabe-se que o fenômeno da deficiência de um metal pode levar ao excesso de outros em diversas espécies e, portanto, as plantas devem possuir mecanismos para lidar com o influxo de metais potencialmente tóxicos durante casos de deficiência. Recentemente, foi proposto que em Arabidopsis a ferroportina AtFPN2 está envolvida com esse mecanismo de transporte e detoxificação de metais durante a deficiência de Fe. Nada se sabe até o momento sobre as ferroportinas de outras espécies de plantas. O objetivo desse trabalho foi contribuir para a elucidação dos mecanismos de regulação da homeostase e transporte de metais em plantas de arroz, estudando a função, regulação e localização das proteínas homólogas a ferroportinas. Foram encontrados três possíveis genes de ferroportinas no genoma do arroz: um com homologia a AtFPN1 e AtFPN2 (Os06g36450) nomeado OsFPN1, e dois com homologia a AtMAR1 (Os12g37530 e Os05g04120), nomeados OsMARL1 e OsMARL2 (MAR Like), respectivamente. A proteína OsFPN1 possui 53% de similaridade com a proteína AtFPN2 e tem predição de ser um transportador vacuolar, similar a AtFPN2. OsFPN1 conferiu tolerância a Fe quando expressa na levedura Δccc1, defectiva para transportadores vacuolares de Fe. A localização da proteína OsFPN1 fusionada a GFP, expressa em células de levedura, foi vacuolar Além disso, OsFPN1 teve expressão regulada por Fe e Ni na parte aérea de plantas de arroz. As proteínas OsMARL1 e OsMARL2 compartilham 48% e 41% de similaridade com a proteína AtMAR1. OsMARL1 tem predição de ser um transportador de cloroplasto, assim como AtMAR1, enquanto OsMARL2 tem predição de ser um transportador de mitocôndria. O gene OsMARL1 pode produzir dois transcritos distintos, denominados a e b. O transcrito OsMARL1a teve expressão regulada pelos níveis de Fe e Ni na parte aérea. OsMARL1b apresentou regulação da expressão por Ni nas raízes. OsMARL1 não foi capaz de resgatar o crescimento de nenhuma das linhagens de leveduras mutantes testadas até o momento. O padrão de expressão de OsFPN1, OsMARL1a, OsMARL1b e OsMARL2 durante o desenvolvimento reprodutivo indica um possível envolvimento das ferroportinas neste processo. Complementação de plantas de Arabidopsis contendo mutações nos genes de ferroportina com o gene de arroz OsFPN1 está em andamento, assim como a análise de plantas de arroz contendo mutação no gene Osmarl1. Os resultados suportam a hipótese de que OsFPN1 pode ser a proteína ortóloga a AtFPN2 em arroz. Os resultados obtidos até o momento para OsMARL1 não permitem inferir uma possível função da proteína no transporte de metais, nem confirmar sua localização. OsMARL2 parece ter sido originado por um evento de duplicação do gene OsMARL1, e estar passando por um processo de perda de função. A caracterização funcional das ferroportinas de arroz pode fornecer informações a serem consideradas para o desenvolvimento de estratégias de sucesso para a biofortificação do grão de arroz com minerais essenciais.

Studies involving the homeostasis of essential mineral nutrients in plants are very important, because without them the plants are unable to complete their life cycle. These mineral nutrients are obtained mainly from the soil and their concentrations must be finely regulated. In rice, these studies are even more important due to the nutritional and economic importance of this crop. In plants, deficiency of one metal can lead to excess of others, and therefore plants must possess mechanisms to deal with the influx of potentially toxic metals during deficiency events. Recently, it has been proposed that the Arabidopsis ferroportin AtFPN2 is involved with this mechanism of transport and detoxification of metals during Fe-deficiency. Nothing is known about ferroportins from other plant species. The aim of this work was contribute to the elucidation of the mechanisms of homeostasis and transport of metals in rice plants, studying the function, regulation and localization of proteins homologous to ferroportins. Three putative ferroportin genes were found in rice genome: one with homology to both AtFPN1 and AtFPN2 (Os06g36450) named OsFPN1, and two with homology to AtMAR1 (Os12g37530 and Os05g04120), named OsMARL1 and OsMARL2 (MAR Like), respectively. The OsFPN1 protein shares 53% similarity with AtFPN2 and it is predicted to be a vacuolar transporter, similarly to AtFPN2. The OsFPN1 confers tolerance to Fe when expressed in the yeast strain Δccc1, defective in vacuolar iron transport. The localization of OsFPN1 fused to the GFP protein was vacuolar in yeast cells .In addition, OsFPN1 had its expression regulated by Fe and Ni in plant shoots. The OsMARL1 and OsMARL2 proteins share 48% and 41% similarity with AtMAR1. OsMARL1 is predicted to be a chloroplast transporter, as AtMAR1, while OsMARL2 is predicted to be a mitochondrial transporter. OsMARL1 gene can produce two distinct transcripts: OsMARL1a and OsMARL1b. OsMARL1a had expression regulated by Fe and Ni levels in plant shoots. OsMARL1b expression was regulated by Ni in plant roots. OsMARL1 was unable to rescue the growth of mutant yeast strains tested so far. The expression pattern of OsFPN1, OsMARL1a, OsMARL1b and OsMARL2 during reproductive development indicates a possible involvement of ferroportins in this process. Complementation of Arabidopsis ferroportin mutants with the OsFPN1 gene are in progress, as well as analyses of the Osmarl1 rice mutant. These results support the hypothesis that OsFPN1 may be the ortholog of AtFPN2 in rice. The results obtained so far do not allow to infer a possible role of the OsMARL1 protein in metal transport or to confirm its intracellular localization. An evaluation of the gene structure of OsMARL2 suggests that this gene was originated after duplication of OsMARL1, and this gene could be going through a process of loss of function. Functional characterization of rice ferroportins can provide useful information to be considered for designing of successful strategies for rice biofortification with essential minerals.