Obtenção de uma nova classe de sais imidazólicos com potencial atividade antifúngica via metátese cruzada de derivados naturais

Abstract

O desenvolvimento de novos medicamentos para tratamento de infecções graves causadas por fungos do gênero Candida é de suma importância, tendo em vista o aumento dos casos de pacientes contaminados com cepas resistentes aos medicamentos disponíveis. Diante desse quadro, é também interessante que novos medicamentos possam ser obtidos por rotas sustentáveis, partindo de substratos provenientes de fontes naturais. Os substratos fenilpropenoides foram submetidos a reações de metátese cruzada (CM, do inglês cross metathesis) com ácido maleico (MA-H, do inglês maleic acid), obtendo-se ácidos carboxílicos α,β-insaturados, da classe dos ácidos cinâmicos, utilizando como catalisador o complexo de rutênio Grubbs de segunda geração (G2). Nas reações de CM dos fenilpropenoides com MA-H, a molécula de anetol foi tomada como substrato modelo. A CM entre anetol e MA-H foi investigada e vários parâmetros foram otimizados, como razão molar do catalisador em relação ao anetol, razão anetol:MA-H, concentração do substrato e temperatura. Todas as reações foram realizadas em 30 minutos. Se obteve uma condição otimizada com 0,25 mol% de catalisador G2 em relação ao substrato, razão anetol:MA-H de 1:2, concentração de substrato de 2,53 mol.L-1 e temperatura igual a 50 °C, onde a conversão foi de 95% e a seletividade para o produto de CM foi de 52%. As condições otimizadas foram aplicadas aos fenilpropenoides isoeugenol e isosafrol. Para o isoeugenol se obteve a melhor conversão, acima de 99% e rendimento para o produto de CM de 99%. Ácido cinâmico e ácido 4-metoxicinâmico foram convertidos em moléculas do tipo N-2-cloroetilcinamamidas. As N-2-cloroetilcinamamidas foram aplicadas na alquilação de n-alquilimidazois, para obtenção de uma nova classe de sais imidazólicos (SI). As propriedades antifúngicas desses sais foram avaliadas através do ensaio de concentração inibitória mínima (CIM) com cepas de Candida. No ensaio de CIM foram testadas as N-2- cloroetilcinamamidas e os SI em comparação com o fármaco comercial fluconazol. As cepas foram sensíveis a todas as moléculas testadas, porém as cinamamidas mostraram valores de CIM pouco significativos. Todos os SI apresentaram valores de CIM próximos ao do fluconazol. O SI com melhor XVII valor de CIM foi o cloreto de (E)-1-(2-cinamamidoetil)-3-hexadecilimidazólio, que foi de 1 μg/mL-1 para Candida albicans e C. tropicalis. Foram também realizadas reações de autometátese (AM) dos fenilpropenoides anetol, isoeugenol e isosafrol, se obtendo como produtos moléculas estilbenoides com conversões ≥ 90% e rendimentos ≥ 88%. Ensaios antioxidantes e de citotoxicidade foram realizados com os estilbenóides, a fim de avaliar tais propriedades nessas moléculas. O ensaio antioxidante foi realizado pelo método FRAP (Método de Redução do Ferro) e somente a molécula proveniente da AM do anetol, (E)-4,4’-dimetoxiestilbeno, apresentou potencial antioxidante. Os ensaios de citotoxicidade foram realizados com células HaCaT com e o marcador mitocondrial MTT (brometo de [3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio]) e também com células Vero utilizando os marcadores MTT e o marcador lisossomal vermelho neutro (VN) (3-amino-7- dimetilamino-2-metilfenazina). Os ensaios utilizando células HaCaT apontou citotoxicidade considerada relevante apenas para o estilbeno (E)-3,3'-dimetoxi- 4,4'-dihidroxiestilbeno, derivado do isoeugenol. No ensaio com células Vero e marcador lisossomal apenas o estilbeno derivado do isoeugenol apresentou viabilidade celular acima de 70% para todas as concentrações, enquanto que para o marcador mitocondrial essa mesma molécula foi a única a apresentar viabilidade celular inferior a 70%, na concentração mais alta.

The development of new drugs to treat severe infections caused by fungi of the genus Candida is of paramount importance in view of the increase in cases of patients contaminated with strains resistant to the available drugs. Simultaneously, it is also of interest to develop sustainable routes for the preparation of new drugs, using substrates from natural sources like phenylpropenoids. Phenylpropenoid substrates were submitted to cross-metathesis (CM) reactions with maleic acid (MA-H). α,β-Unsaturated carboxylic acids of the cinnamic acid class were obtained when the second-generation Grubbs ruthenium complex (G2) was applied as catalyst. In the CM reactions of phenylpropenoids with MA-H, anethole was taken as model substrate. The CM between anethole and MA-H was investigated and several parameters were optimized, such as molar ratio of the catalyst to anethole, anethole:MA-H molar ratio, substrate concentration and temperature. The reaction time was kept constant at 30 minutes, and the optimized conditions were as follows: 0.25 mol% of catalyst G2 in relation to the substrate, anethole:MA-H molar ratio of 1:2, substrate concentration of 2.53 mol.L-1 and temperature of 50 °C; resulting in a conversion of 95% and a CM selectivity of 52%. Both phenylpropenoids isoeugenol and isosafrole were applied under the optimized conditions. The best conversion and CM yield were achieved with isoeugenol, being ≥99% and 99%, respectively. Commercial cinnamic acid and 4-methoxycinnamic acid obtained through CM were converted to N-2-chloroethylcinnamamide molecules. The N-2-chloroethylcinnamamides were applied in the alkylation of n-alkylimidazoles to obtain a new class of imidazolium salts (IS). The antifungal properties of both N-2-chloroethylcinnamamides and IS were tested in the minimum inhibitory concentration (MIC) assay with Candida strains, using the commercial drug fluconazole as comparison. The strains were sensitive to all the molecules tested, but the N-2-chloroethylcinnamamides showed less significant MIC values. All IS had MIC values close to those of fluconazole, and the best MIC value of 1 μg.mL-1 against Candida albicans and C. tropicalis was obtained with (E)-1-(2-cinnamamidethyl)-3-n-hexadecylimidazolium chloride, outperforming fluconazole. Self-metathesis (AM) reactions with the phenylpropenoids anethole, isoeugenol and isosafrol resulted in the formation of stilbenoids with conversions ≥ 90% and yields ≥ 88%. These stilbenoids were submitted to antioxidant and cytotoxicity assays. The antioxidant assay was performed by the FRAP (FRAP – Ferric Reducing Antioxidant Power) method, which showed antioxidant potential for the molecule from the anethole AM, (E)-4,4'- dimethoxystilbene. Cytotoxicity assays were performed with HaCaT cells and the MTT mitochondrial marker ([3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide]), and also with Vero cells using the MTT and the neutral red (VN) lysosomal markers (3-amino-7-dimethylamino-2- methylphenazine). Assays using HaCaT cells demonstrated relevant cytotoxicity only for (E)-3,3'-dimethoxy-4,4'-dihydroxystilbene, derived from isoeugenol. In the assay with Vero cells and the lysosomal marker, the stilbene derived from isoeugenol presented cell viabilities above 70% for all tested concentrations. In contrast, when applying the mitochondrial marker, the same molecule was the only one to present cell viability of less than 70% at the highest concentration tested.