Seleção e caracterização de Papiliotrema flavescens BI281, uma nova levedura oleaginosa isolada no sul do Brasil

Abstract

O biodiesel de terceira geração, cuja matéria prima é obtida a partir de microrganismos, é a alternativa promissora para substituir grandes cultivos com finalidade combustível. Os organismos oleaginosos mais estudados são microalgas e leveduras, onde a levedura mostra algumas vantagens que conferem viabilidade e potencial para ser aplicada em nível industrial. Porém, o esforço de triagem de leveduras selvagens com capacidade acumuladora de lipídio não é suficiente e novas metodologias devem ser desenvolvidas para acelerar o processo de seleção. Além disso, a biodiversidade de leveduras do Rio Grande do Sul (Brasil) tem sido pouco explorada, apesar dos relatos na literatura do grande potencial de acúmulo de lipídios em leveduras da região. Neste sentido, o objetivo principal desta tese foi avaliar a habilidade de acumulação de lipídios em leveduras de uma coleção, cujas fontes de isolamento foram (1) estruturas de plantas bromélias do parque Itapuã (Viamão, RS), e (2) plantas macrófitas associadas a marismas da lagoa dos Patos, Rio Grande (RS). De 55 leveduras recuperadas e avaliadas, quatro linhagens mostraram capacidade oleaginosa a partir de determinação gravimétrica, observação em microscopia de fluorescência e leituras de cinética do acúmulo de lipídios usando intensidade de fluorescência. Três linhagens foram identificadas como Papiliotrema flavescens (BI281, BI283, BI296) e uma linhagem como Vishniacozyma sp. BI237. Estas espécies são descritas pela primeira vez como oleaginosas. Foi testado o corante fluorescente 2-(1,3-benzothiazol-2-yl)-5-(N,N-dyethylamino)phenol, denominado nessa tese como “Gaúcho Dye (GD)”. Este corante foi comparado com o vermelho de Nilo em duas leveduras oleaginosas e uma levedura não oleaginosa. Os resultados sugerem que o corante GD é lipofílico, marca fluorescência nas gotas lipídicas, e em espectrofluorimetria mostra duas bandas de emissão, o que é relacionado com a sua natureza química. O mecanismo de transferência de protons intramolecular no estado excitado (ESIPT em inglês) pode ser evidenciado de acordo com o solvente empregado e células com acúmulo de lipídios. Os resultados sugeriram a segunda banda de emissão com maior afinididade lipofílica à molécula. Por tudo isso, as propriedades espectroquímicas são vantajosas quando comparadas com o vermelho de Nilo, principalmente pela sua fotoestabilidade. Assim, esta tese envolveu a ampliação da lista de leveduras relatadas como acumuladoras de lipídios, a otimização da produção de lipídios em P. flavescens BI281 e obtenção do seu perfil lipídico. P. flavescens BI281 está sendo proposta como matéria prima para produção de biodiesel. Além disso, um novo corante para marcação de leveduras oleaginosas com propriedades fotoquímicas melhoradas foi avaliado.

Third generation biodiesel, where the feedstock are oleaginous microorganisms, is an promissor alternative to replace vegetable crops to produce fuel. The most studied oleaginous organisms are microalgae and yeasts, where yeast showed advantages that offer economic viability and potential to be applied in industry. However, the effort of native yeast screening with lipid-accumulating ability is not enough, and new methodologies should be developed to accelerate the selection process. Moretheless, the yeast biodiversity in Rio Grande do Sul (Brazil) had been little explored besides reports literature of great potential lipid-accumulating ability in yeasts of the region. In this sense, the objective of this thesis was to assess the lipid-accumulating ability in our yeast collection, with focus in two isolation sources: (1) bromeliads plants and structures from Itapuã park (Viamão, RS), and (2) macrophyte plants associated to a marshland in “lagoa dos Patos”, Rio Grande (RS). From 55 recovered and assessed yeasts, four strains showed oleaginous ability using gravimetric determination, observation in fluorescence microscopy and fluorescence kinetics readings. Three strains were identified as Papiliotrema flavescens (BI281, BI283, BI296) and the other one as Vishniacozyma sp. BI237. These species are described for first time as oleaginous in this Thesis. We tested the fluorescent dye 2-(1,3-benzothiazol-2-yl)-5-(N,Ndyethylamino) phenol, and was called “Gaúcho Dye (GD)”. This dye was compared to Nile red in two oleaginous strains and one non-oleaginous strain. Our results suggested that “GD” dye is lipophilic, stain lipid droplets, presents ESIPT property only in presence of oleaginous yeast and showed advantageous characteristics when compared to Nile red., being photostable. Therefore, this thesis involved list expansion of novelty oleaginous species, optimization of lipid production in P. flavescens BI281 and obtained their lipid profile. P. flavescens BI281 is proposed as feedstock for biodiesel. Furthermore, a new fluorescent dye to stain oleaginous yeasts, called GD, with improved photochemical properties, was assessed.