Influência de metais tóxicos nas enzimas do sistema purinérgico e na aceticolinesterase em sistema nervoso central do peixe zebra (Danio rerio)

Abstract

A poluição ambiental causada por resíduos de metais tóxicos é muito relevante pelo seu amplo uso em processos industriais e agrícolas, sendo que muitos efluentes chegam ao ambiente aquático sem qualquer tratamento. A contaminação da água com estes poluentes tornaram-se iminentes e, consequentemente efeitos adversos são inevitáveis em humanos, plantas e animais, onde um dos táxons mais atingidos são os peixes. O peixe zebra (Danio rerio) é uma espécie muito utilizada como modelo experimental em diversas áreas, como neurociências e toxicologia. Evidências demonstram que nucleotídeos e nucleosídeos da adenina exercem efeitos sinalizadores no espaço extracelular por meio da ativação de receptores específicos. A inativação do sinal mediado pelo ATP extracelular é realizada por uma família de enzimas denominadas ectonucleotidases, na qual se destacam as NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e a ecto-5'-nucleotidase. Após hidrólise pelas ectonucleotidases, o ATP produz o nucleosídeo adenosina. A adenosina pode ser desaminada pela enzima adenosina desaminase (ADA), gerando inosina. Evidências demonstram que o ATP é coliberado com a acetilcolina em terminais colinérgicos. A acetilcolina é uma molécula transmissora que age nos receptores muscarínicos e nicotínicos e seu catabolismo é promovido pela enzima acetilcolinesterase (AChE). Nosso laboratório já demonstrou a presença de diferentes membros da família das NTPDases e da família da ADA, além de uma ecto-5'-nucleotidase em cérebro de peixe zebra. A presença da enzima AChE também já foi descrita nesta espécie. No capítulo I foi testado o efeito in vitro do zinco e cádmio na atividade da AChE e das ectonucleotidases em cérebro de peixe zebra. Ambos os metais não alteraram a atividade da AChE. A hidrólise de ATP teve um aumento na presença de 1 µM de zinco (17 %) e a hidrólise de AMP teve um aumento dose dependente nas concentrações 0,5 e 1 µM de zinco (188 % e 199 %). Após a exposição a 0,5 e 1 µM de cádmio, a atividade ATPásica foi aumentada significativamente (53 % e 48 %). O cádmio na faixa de 0,25 a 1 µM inibiu a hidrólise de ADP de forma dose-dependente (13,4 - 69 %). A atividade da ecto-5'-nucleotidase foi inibida (38 %) apenas na presença de 1 µM de cádmio. No capítulo II foi investigado o efeito da exposição ao alumínio na atividade da AChE cerebral e em parâmetros comportamentais em peixe zebra. A exposição in vivo a 50 µg/L de AlCl3 durante 96 h a pH 5,8 aumentou significativamente (36 %) a hidrólise de acetiltiocolina em cérebro de peixe zebra. Não foram observadas mudanças na atividade da AChE quando os peixes foram expostos a mesma concentração de AlCl3 em pH 6,8. RT-PCR semi-quantitativo não demonstrou alterações significativas nos níveis de expressão do RNAm do gene da ache em cérebro de peixe zebra. Concentrações in vitro de AlCl3 variando de 50 a 250 µM aumentaram a atividade da AChE (28 a 33 %). Além disso, animais expostos ao AlCl3 em pH 5,8 apresentaram uma diminuição na atividade locomotora, avaliada pelo número de cruzamentos (25 %), distância viajada (14,1 %) e velocidade máxima (24 %). No capítulo III, foi verificado o efeito de metais tóxicos na atividade e expressão da ADA em frações solúveis e de membrana em cérebro de peixe zebra. Dos metais testados, apenas o mercúrio foi capaz de inibir a desaminação da adenosina em ambas as frações in vitro. A inibição foi observada de 5 a 250 µM de HgCl2 (84,6 - 92,6 %) na fração solúvel enquanto nas frações de membrana a inibição variou de 50 a 250 µM (20,9 - 26 %). A exposição in vivo do peixe zebra a 20 µg/L de HgCl2 foi avaliada após exposição aguda (24 h) e subcrônica (96 h). A atividade da ADA na fração solúvel foi inibida após a exposição aguda (24,5%) e subcrônica (40,8%) enquanto que a atividade da ADA na fração de membrana foi inibida somente após a exposição subcrônica (21,9 %). Em contraste, não foram observadas mudanças na expressão dos genes da ADA após os tratamentos. Nossos resultados apresentados demonstraram que as enzimas envolvidas na degradação de nucleotídeos e nucleosídeos (NTPDase, 5'-nucleotidase e ADA) e a acetilcolinesterase são afetadas por metais tóxicos em cérebro de peixe zebra. Além de serem possíveis alvos da neurotoxicidade dos metais, a alteração destas atividades enzimáticas pode ser utilizada como bioindicador da presença ambiental destes poluentes.

The environmental pollution caused by toxic metals is relevant due to its widespread use in industrial and agricultural process, and many effluents enter in the aquatic environment without treatment. The contamination of water by toxic metals has become imminent and, consequently, adverse effects are inevitable in humans, plants, and animals, which fish are one of the most affected taxons. Zebrafish (Danio rerio) is a specie consolidated as a model system in many research areas, including neuroscience and toxicology. Evidence has show that nucleotides and nucleosides exert signaling effects at the extracellular space by the activation of specific receptors. The inactivation of extracellular ATP signaling is promoted by a family of enzymes named ectonucleotidases, whivh inlude NTPDases (nucleoside triphosphate diphosphohydrolases) and ecto-5'-nucleotidase. After hydrolysis promoted by ectonucleotidases, ATP forms the nucleoside adenosine. The adenosine could be deaminated by the enzyme adenosine deaminase (ADA). Evidence demonstrates that ATP is coreleased with acetylcholine in cholinergic terminals. Acetylcholine is a transmitter molecule that acts on muscarinic and nicotinic receptors and its catabolism is promoted by acetylcholinesterase (AChE) activity. Our laboratory has already characterized NTPDases, ecto-5'-nucleotidase and ADA activity in zebrafish brain. The AChE activity has been reported in this specie. In chapter I we tested the in vitro effect of zinc and cadmium on AChE and ectonucleotidase (NTPDase and ecto-5-nucleotidase) activities in zebrafish brain. Both zinc and cadmium treatments did not alter significantly the zebrafish brain AChE activity. ATP hydrolysis presented a significant increase at 1 mM zinc (17 %) and the AMPase activity had a dose-dependent increase at 0.5 and 1µM zinc exposure (188 % and 199 %). After cadmium treatment, ATPase activity was significantly increased (53 % and 48 %) at 0.5 and 1 µM, respectively. Cadmium, in the range 0.25-1 µM, inhibited ADP hydrolysis in a dose-dependent manner (13.4-69 %). Ecto-5-nucleotidase activity was only inhibited (38 %) in the presence of 1 µM cadmium. In chapter II we have investigated the effect of aluminum exposure on brain AChE activity and behavior parameters in zebrafish. In vivo exposure of zebrafish to 50 µg/L AlCl3 during 96 h at pH 5.8 significantly increased (36 %) acetylthiocholine hydrolysis in zebrafish brain. There were no changes on AChE activity when fish were exposed to the same concentration of AlCl3 at pH 6.8. Semi-quantitative RT-PCR has not shown significant alterations on the expression levels of ache mRNA gene in zebrafish brain. In vitro concentrations of AlCl3 varying from 50 to 250 µM have increased AChE activity (28 to 33 %, respectively) Moreover, we observed that animals exposed to AlCl3 at pH 5.8 presented a significant decrease in locomotor activity, as evaluated by the number of line crossings (25 %), distance traveled (14.1 %) and maximum speed (24 %). In chapter III we have investigated the effects of toxic metals on soluble and membrane ADA activity and gene expression in zebrafish brain. Regarding the metals tested, only HgCl2 was able to inhibit the adenosine deamination in vitro in both fractions. The inhibition was observed from 5 to 250 µM HgCl2 (84.6 - 92.6 %) in soluble fraction while in membrane fractions the inhibition varied from 50 to 250 µM (20.9 - 26 %). The in vivo exposure of zebrafish to 20 µg/L of HgCl2 was evaluated after acute (24 h) and subchronic (96 h) treatments on ADA activity in soluble and membrane fractions. The ADA activity from soluble fraction was inhibited after both acute (24.5 %) and subchronic (40.8 %) exposures whereas the ADA activity from brain membranes was inhibited only after subchronic exposure (21.9 %). In contrast, semi-quantitative RT-PCR analysis showed that HgCl2 was not able to modulate the ADA gene expression. Our results have show that the enzymes involved in the degradation of nucleotides and nucleosides (NTPDase, 5'-nucleotidase and ADA) and AChE are modulated by toxic metals in zebrafish brain. Besides been a possible target in the neurotoxicity mediated by metals, the alteration of these enzyme activities can be used as bioindicator of the environmental presence of these pollutants.