Avaliação do silenciamento gênico em plantas utilizando estratégias baseadas em dsRNAs

Abstract

O silenciamento gênico tem sido utilizado extensivamente para facilitar a investigação de eventos da biologia vegetal. Ele pode ser induzido de diferentes modos, sendo que o passo chave para sua ocorrência é a presença de RNA fita dupla (dsRNA). A fim de avaliar um método rápido de obtenção de silenciamento para análise funcional em larga escala, foi inoculado dsRNA ou siRNA diretamente em folhas de plantas de arroz e de Nicotiana benthamiana. Os dsRNAs de seqüências do gene pds e do gene codificante da ferritina foram obtidos através da síntese in vivo e in vitro e o siRNA de PDS de arroz, derivado somente de síntese in vitro. O gene pds codifica a enzima fitoeno desaturase (PDS), uma enzima chave na biossíntese de carotenóides, que protege a clorofila das plantas contra o foto-branqueamento. O silenciamento deste gene mostra um fenótipo visível, claramente demonstrado através do uso de um inibidor químico da síntese desta enzima. No presente estudo, plantas de arroz e de N. benthamiana inoculadas com dsRNAs derivados do gene pds não apresentaram mudanças fenotípicas. Para avaliação de um outro método foi adaptado um vetor de silenciamento estável, no qual foram inseridos fragmentos de cDNA nas orientações senso e antisenso do gene de ferritina de arroz. O papel da ferritina, segundo experimentação in vitro, pode estar ligada à tolerância de certos cultivares de arroz às altas concentrações de ferro. O aprimoramento das metodologias de silenciamento e de transformação poderá resultar em uma ferramenta mais útil para a análise funcional em larga escala de genes de arroz.

Gene silencing has been used extensively to facilitate the investigation of different events in plant biology. It can be induced through different ways. The key step for its occurrence is the presence of double strand RNA (dsRNA). In order to evaluate a fast method to obtain silencing for functional analysis in a wide scale, either dsRNAs or siRNAs were directly inoculated in the leaves of rice and N. benthamiana plants. The dsRNAs the sequences of the pds gene and of the coding region of the ferritin gene were obtained through in vivo or in vitro synthesis, the siRNA PDS of rice were derived from synthesis in vitro. The pds gene codifies for the enzyme phytoene desaturase (PDS), a key enzyme in the biosynthesis of carotenoids, which protects the clorophil from the plants against photo-bleaching. The silencing of this gene shows a visible phenotype, clearly demonstrated through a chemical inhibition of PDS synthesis. However, no phenotypical changes were observed in either rice or N. benthamiana plants inoculated with dsRNA of the pds gene. In the present study, it was also adapted a vector for stable transformation, in which were inserted cDNA fragments of both, sense and antisense, orientations of the rice ferritin gene. In vitro experiments show that ferritin could be connected to the tolerance to high concentrations of iron of certain cultivars of rice. The improvement of silencing and transformation methodologies could result in a more useful tool for the functional analysis of rice genes in a wide scale.