Investigação de genes responsáveis por síndromes associadas a malformações de membros e seu papel na teratogênese da talidomida

Abstract

A talidomida é um fármaco que foi sintetizado pela primeira vez em 1954. Poucos anos após sua síntese já era amplamente utilizada para uma série de indicações. No início da década de 1960, a alta incidência de bebês nascidos com defeitos de redução de membros foi correlacionada com o uso de talidomida por mulheres grávidas. Em torno de 20-50% dos embriões expostos à talidomida foram afetados e desenvolveram as malformações características da embriopatia por talidomida (TE). Atualmente sabe-se que o background genético dos indivíduos tem um papel importante nessa suscetibilidade, entretanto, os fatores associados à maior suscetibilidade e aqueles relacionados a diferentes fenótipos dentro da TE não são totalmente conhecidos. Algumas síndromes genéticas têm fenótipos muito semelhantes aos visualizados na TE, sendo a TE considerada uma fenocópia destas síndromes. As principais são: Síndrome de Roberts, Síndrome de Duane de raio radial – também chamada Síndrome de Okihiro –, e Síndrome de Holt-Oram, causadas por mutações nos genes ESCO2, SALL4 e TBX5, respectivamente. A análise das bases moleculares e patogênese de síndromes genéticas de fenótipo similar a embriopatias causadas por fármacos (fenocópias) tem ajudado na compreensão de alguns mecanismos teratogênicos. O objetivo desse trabalho foi investigar a contribuição dos três genes acima citados na suscetibilidade à TE e seu papel nas diferentes anomalias congênitas e doenças observadas nos indivíduos afetados. Os éxons e regiões flanqueadoras (UTRs e cerca de 50 pb dos íntrons adjacentes) desses três genes foram sequenciados em 29 indivíduos afetados pela TE e as variantes encontradas foram avaliadas através de preditores funcionais in silico. Quarenta e uma variantes foram identificadas, 11 (27%) no gene ESCO2, 14 (34%) no gene SALL4 e 16 (39%) no gene TBX5. Inserções e deleções estavam presentes apenas no gene ESCO2. Duas das variantes identificadas, uma em ESCO2 e uma em TBX5, não estavam descritas previamente em bancos de dados genômicos. Doze (29%) eram variantes genéticas raras (<0,01). As frequências alélicas e genotípicas das variantes foram determinadas na nossa amostra e comparadas com dados da população européia do Projeto 1000 Genomas. Não foram identificados alelos ou genótipos que conferissem risco ou proteção para a TE. As frequências foram significativamente diferentes entre os dois grupos apenas para uma variante 3'UTR (rs62498042) do gene ESCO2 (p<0,001), entretanto, não há relatos na literatura do papel funcional dessa variante ou de sua associação com aumento da susceptibilidade para alguma doença. A análise in silico que realizamos sugeriu possível alteração de splicing devido à presença dessa variante. Algumas variantes aqui identificadas foram previamente avaliadas em doenças cardiovasculares e malformações cardíacas. Nós comparamos a frequência dessas variantes em indivíduos com TE que apresentavam alguma anomalia cardíaca ou doença cardiovascular e aqueles que não apresentavam tais condições; entretanto, não houve associação entre a presença das variantes e risco aumentado para alguma anomalia cardíaca ou doença cardiovascular. Análises in silico foram realizadas a fim de avaliar o potencial de todas as variantes encontradas para alterações funcionais nas proteínas, alterações no splicing e em sítios de ligação de fatores de transcrição e miRNAs. Muitas variantes foram consideradas como tendo tal potencial, especialmente de afetar o splicing, entretanto, não foi possível estabelecer o papel dessas variantes no decaimento do mRNA desses genes, na formação de isoformas alternativas ou ainda na diminuição da expressão dos genes. Alguns resultados devem ser melhor explorados através de ensaios funcionais para determinar o papel das variantes na atividade das proteínas, no mecanismo molecular de desenvolvimento de anomalias congênitas e na teratogênese da talidomida.

Thalidomide is a drug that was first synthesized in 1954. Following its release on to the market, thalidomide was already widely used for a diverse number of indications. The high incidence of babies being born with limb reduction defects in early 1960s was related with the use of thalidomide by pregnant women. Around 20-50% of the embryos exposed to thalidomide were affected and developed the characteristic malformations of thalidomide embryopathy (TE). Currently is known that the genetic background of the individuals plays an important role in this susceptibility; however, the factors associated with higher susceptibility and those related to different phenotypes are not fully known. Some phenotypes observed in TE are very similar to characteristics seen in some genetic syndromes. Because of that, TE is considered a phenocopy of these syndromes. The main syndromes that TE is phenocopy are: Roberts Syndrome, Duane Radial Ray Syndrome (also known as Okihiro Syndrome) and Holt-Oram Syndrome, caused by mutations in ESCO2, SALL4 and TBX5 genes, respectively. The analysis of the molecular bases of syndromes of similar phenotype to embryopathy cause by drugs (phenocopies) has helped in the understanding of teratogenic mechanisms. The aim of this study was to investigate the contribution of these three genes in TE susceptibility and theirs role in different congenital anomalies and diseases seen in affected individuals. The exons and flanking regions (UTRs and 50pb of adjacents introns) of these genes were sequenced by next generation sequencing in 29 individuals affected by TE and the variants found were evaluated through bioinformatic tools in silico. Forty-one variants were identified, 11 (27%) in ESCO2, 14 (34%) in SALL4 and 16 (39%) in TBX5. Insertions and deletions were present only in ESCO2 gene. Two of the identified variants, one in ESCO2 and on in TBX5, were not previously described in genomic databases. Twelve variants (29%) were rare (<0.01). The allelic and genotypic frequencies of our sample were determined and compared with data from the European population of 1000 Genomes Project. No allele or genotype was related to risk or protection for TE. The frequencies were significantly different between the two groups for only one 3'UTR variant (rs62498042) found in ESCO2 gene (p <0.001). However, there are no reports on literature of the functional role of this variant or its association with increased susceptibility to some disease. In silico analyses here performed suggested splicing changes due this variant presence. Some variants here identified have been previously evaluated in cardiovascular diseases and cardiac malformations. We compared the frequency of these variants in individuals with TE that presented some cardiac anomaly or cardiovascular disease and those that did not present such conditions; however, there was no association between these variants and increased risk for these conditions. In silico analyses were performed in order to evaluate the potential of the variants for functional alterations in proteins, changes in splicing sites, transcription factors binding sites and miRNA interaction sites. Many variants were considered to have such potential, especially of splicing changes; however, it was not possible to establish the role of the variants in decay of these genes mRNA, or in alternative isoforms formation or in the decrease of these genes expression. Some variants should be further investigated. Functional analyses would be useful to investigate the role of the variants in the proteins activities, in the molecular mechanism of congenital anomalies development and in thalidomide teratogenesis.