Avaliação do papel da proteína ATR na indução de autofagia e senescência por temozolomida em células de glioblastoma

Abstract

Autofagia é um processo de degradação fisiológico aumentado em diferentes condições de estresse, em que proteínas e organelas não funcionais são direcionadas ao lisossomo, onde são degradadas e os produtos da degradação reutilizados pela célula. Senescência é o processo em que as células param de dividir e entram em um estado de parada celular irreversível. Os dois processos, autofagia e senescência, podem ser induzidos na presença de dano no DNA, porém a maquinaria molecular que realiza a intermediação neste processo ainda é incerta. Temozolomida (TMZ) é um agente alquilante, usado para tratar pacientes com Glioblastoma, que induz dano no DNA. Lesões produzidas por TMZ ativam a resposta ao dano no DNA (DDR), uma sinalização complexa que medeia as respostas celulares, tais como a dinâmica do ciclo celular, autofagia, senescência e morte celular, ao dano genotóxico. Dada a importância desses mecanismos, esse trabalho objetiva avaliar o impacto da inibição da cinase Ataxia Telangiectasia mutada dependente de Rad3 (ATR), reguladora chave da DDR, na proliferação, autofagia e senescência em células de glioblastoma tratadas com TMZ. Para tal, nós utilizamos um inibidor farmacológico para ATR (VE-821), bem como shRNA para ATR com vetor lentiviral em células U87. A inibição farmacológica da proteína ATR não alterou o estado autofágico e de senescência em comparação com as células tratadas somente com TMZ. Esses resultados foram obtidos usando o método Laranja de Acridina (AO) e a ferramenta de Análise Morfométrica Nuclear (NMA). Na ausência de uma sinalização dependente de ATR, obtida pelas células shATR tratadas com TMZ, também não observamos alteração significativa em relação a esses processos. No entanto, nós observamos um acúmulo da proteína SQSTM1/p62, substrato da autofagia, nas células silenciadas para ATR. Esta alteração não se refletiu em aumento de foci intracelulares da proteína SQSTM1/p62. Em conclusão, ATR não parece participar diretamente da ativação da Autofagia e da Senescência induzidas por TMZ.

Autophagy is a catabolic process, that shows increased levels in stressful situations, whereby dysfunctional proteins and organelles are engulfed and targeted to lysosomes for degradation and recycled back to the cell. Senescence is the process by which cells stop dividing and enter a state of growth arrest. Both processes, autophagy and senescence, can be induced by DNA damage, however, the molecular machinery that mediates this process is still uncertain. Temozolomide (TMZ) is an alkylating agent, used to treat patients with Glioblastoma, that drives DNA damage. Lesions produced by TMZ activate the DNA damage response (DDR), a complex signalling pathway, that mediates cellular outcomes such as cell cycle distribution, autophagy, senescence and cellular death, to genotoxic damage. Given the importance of such mechanisms, this work aims to evaluate the impact of inhibiting the Ataxia telangiectasia and Rad3 related (ATR) kinase, key regulator of the DDR, on cellular proliferation, autophagy and senescence, on Glioblastoma (GBM) cells treated with TMZ. In order to do that, we used a pharmacological inhibitor for ATR (VE-821) as well as shRNA to ATR, in U87 cells using lentiviral vectors. The pharmacological inhibition of ATR did not alter the autophagic or senescence status in comparison with the cells treated with TMZ only. Such results were obtained by Acridine Orange (AO) assessment and Nuclear Morphometric Analysis (NMA) tool. In the absence of an ATR dependent signalling, assessed through shATR cells treated with TMZ, no significant alteration in relation to such processes was seen. However, we observed an accumulation of the SQSTM1/p62 protein, a selective autophagy substrate, on cells silenced for ATR. This accumulation did not reflect in increased intracellular foci formation of SQSTM1/p62 protein. In conclusion, ATR doesn't seem to play a direct role in the Autophagy and Senescence induced by TMZ.