Caracterização morfofuncional dos circuitos centrais e periféricos que controlam as atividades digestivas do caracol : Megalobulimus abbreviatus

Abstract

A organização do sistema nervoso que controla as funções digestórias dos moluscos gastrópodes tem sido estudada quanto à constituição dos circuitos neurais subjacentes ao ritmo de deglutição alimentar. Existe, entretanto, uma lacuna no conhecimento da organização do sistema nervoso central (SNC) e periférico (SNP) que regulam o segmento médio e posterior do trato digestório. A posição filogenética intermediária, atribuída ao sistema nervoso (SN) do caracol Megalobulimus abbreviatus, entre as espécies de Helicidae e os basomatófaros pode constituir uma via para o entendimento do controle da atividade do trato gastrointestinal (tGI) de gastrópodes. Assim sendo, o caracol pulmonado M. abbreviatus foi utilizado em um estudo morfológico e neuroquímico que buscou descrever o padrão da inervação central e periférica em um modelo experimental amplamente utilizado na pesquisa neurobiológica. A anatomia macroscópica revelou que o intestino médio constituiu-se pelo estômago, dividido em pró-ventrículo e moela, e intestino, dividido em pró-intestino ou tiflossolear, médio e pós-intestino, enquanto que o intestino posterior constituiu-se pelo reto e ânus. A análise da organização da parede, empregando microscopia óptica, revelou a presença de quatro túnicas constituindo a parede destes órgãos: (i) mucosa, que se constituía por um epitélio colunar intermitente ciliado e lâmina própria; (ii) submucosa, representada pelo tecido conjuntivo frouxo, contendo muitos espaços hemais; (iii) muscular, dividida em camadas circular interna e longitudinal externa, contudo a moela apresentou uma camada disposta obliquamente e as regiões cárdica e pilórica apresentaram esfíncteres muito organizados (iv) serosa, constituída por tecido conjuntivo frouxo delimitado por um mesotélio. O intestino médio recebe inervação central por meio do ramo gastro-intestinal (rG) do nervo visceral comum (nV), enquanto que o intestino posterior foi inervado pelo nervo reto-anal (nR). A aplicação de marcações retrógradas com cloreto de cobalto acrescido de albumina sérica bovina, biocitina e Horseradish peroxidase no rG e no nR revelou que a maioria dos neurônios envolvidos no controle destes órgãos estão localizados no complexo ganglionar víscero-parietal. Ainda foi observada a presença de uma rede constituída por quatro gânglios (estomatogástrico, cárdico, gástrico e pilórico) interconectados por nervos e localizados sobre a parede do estômago, sendo denominado sistema nervoso estomatogástrico (SNEG). O traçamento anterógrado com Lúcifer Yellow revelou que fibras oriundas do SNEG se projetam para os plexos entéricos, submucoso (PS) e mioentérico (PM), localizados entre as túnicas do tGI. A organização do sistema nervoso entérico (SNE) foi estudada com a aplicação das técnicas de impregnação argentafínica e coloração com azul de metileno. Os plexos entéricos mostraram-se formados por uma extensa rede de axônios e muitos somas neuronais, dispostos em pequenos grupos ou isoladamente. As fibras axonais que inervavam as células da camada muscular longitudinal no estômago eram organizadas em feixes e acompanhavam o comprimento das fibras musculares. O MP distribuía-se por toda a camada muscular circular e longitudinal. No estômago, a região cárdica apresentou um plexo mais denso do que a pilórica, contudo as fibras nervosas dispunham-se entre e ao redor das fibras musculares de ambas as camadas O plexo entérico no intestino apresentou o mesmo arranjo observado na região pilórica, sendo uniforme até o ânus. As duas tiflossoles intestinais, no pró-intestino, apresentaram grande quantidade de fibras nervosas, no entanto não foram observados somas neuronais. Dentre os constituintes do SNE foram observados células nervosas intra-epiteliais (neuron like-intraepithelial cells), que possuem dois tipos morfológicos: aberto (que projeta um cílio para o lúmen intestinal) e fechado (localizado na base do epitélio digestório) e células fusiformes, cuja morfologia e posição lembram as células intersticiais de Cajal. A neuroanatomia química do SNEG e do SNE foi analisada mediante a aplicação de técnicas de histoquímica e imunohistoquímica para diferentes mediadores e transmissores. No intestino médio e posterior foi observado um rico plexo com atividade acetilcolinesterásica (AChE), constituído por fibras oriundas do SNC, via nervos periféricos, e do SNEG. Neurônios e fibras nervosas entéricas mostraram-se esparsos na submucosa e entre as camadas musculares, circular e longitudinal, do estômago, intestino e reto. A atividade de diaforase da nicotinamida adenina dinucleotódeo fosfato (NADPHd) revelou neurônios e fibras nervosas com maior atividade em toda a túnica muscular do que na submucosa. A fluorescência induzida pelo ácido glioxílico (AG) revelou a maior presença de fibras nervosas e varicosidades catecolaminérgicas na submucosa do reto, pós-intestino e moela do que nas outras porções do tGI. A imunorreatividade à serotonina (5HT-ir) foi observada em somas e fibras nervosas distribuídas predominantemente na submucosa do reto e intestino, sendo encontrados poucos neurônios e fibras 5HT-ir no pró-ventrículo e moela Os elementos nervosos FMRF-amida imunorreativos (FMRFa-ir) estavam presentes na mucosa, submucosa e muscular por toda extensão do intestino médio e posterior. As células nervosas intraepiteliais foram mais marcadas pela AChE, 5HT-ir e FMRFa-ir do que pela NADPHd e seus processos se anastomosam formando um extenso e organizado plexo subepitelial. As células fusiformes tiveram os corpos e prolongamentos marcados pelos métodos aplicados, à exceção do AG. Uma intensa imunorreatividade a proteína fibrilar acídica glial (GFAP-ir) por todos os plexos do intestino médio e posterior e nos gânglios do SNEG, sugerindo uma importante função para as células gliais no SNP do tGI de gastrópodes. Assim, pode-se concluir que o controle do tGI no caracol M. abbreviatus possui um controle nervoso extrínseco direto, por meio dos gânglios subesofageais, via rG e nR, e indireto, pelo SNEG para o intestino médio, e uma inervação intrínseca, representada pelos plexos PS e PM, associados às células nervosas intra-epiteliais, que formam o plexo subepitelial tanto no intestino médio como no posterior. A neuroanatomia química permite inferir que, os diferentes transmissores analisados, podem exercer controle sobre a motilidade ou sobre as funções sensoriais e secretomotoras no tGI. Finalizando, a reação ao GFAP é uma evidência da presença de células enterogliais permitindo inferir que exista uma interação entre os constituintes dos plexos neurais com a glia, tal qual ocorre no SNC de gastrópodes e outros invertebrados.

The organization of the nervous system that controls digestive functions of gastropods mollusks has been studied relative to the constitution of the neuronal circuit underlying the deglutition rhythm. However, there is a lacuna in the knowledge about the organization of the peripheral nervous system regulating the medium and posterior segments of the digestive tract. However, there is a lacuna in the knowledge about the organization of the central (CNS) and peripheral nervous system (PNS) that regulates the medium and posterior segments of the digestive tract. The intermediate phylogenetic position attributed to the nervous system (NS) of the snail Megalobulimus abbreviatus, between Helicidae and basommatophoran species may constitute a via for understanding the control of the activity of the gastrointestinal (GI) tract of gastropods. Thus, the pulmonate snail M. abbreviatus was used in a morphological and neurochemical study that sought to describe the pattern of the central and peripheral innervation in an experimental model widely used in neurobiological research. Macroscopic anatomy revealed that the midgut was formed by the stomach, divided into pro-ventricle and gizzard, and intestine, divided into pro-intestine or tiflossolear, medium- and post-intestine, while the hindgut was formed by the rectum and anus. The light microscopy revealed that the GIt wall was constituted by four tunics: (i) the mucosa was constituted by a intermittent ciliated columnar epithelium and lamina propria; (ii) the submucosa was a loose connective tissue, containing a system of haemocoelic spaces; (iii) the muscular was formed by the internal circular and external longitudinal layers, while in the gizzard there was a third muscular layer disposed obliquely and the cardia and pylorus regions contained two sphincters (iv) the serosa display a loose connective tissue covered by a mesothelium. The midgut is innervated by the common visceral nerve, through gastrointestinal branch (Gb), while the hindgut is innervated by the rectum-anal nerve (Rn). Retrogradely backfilling with CoCl2 added with 0.1% bovine albumin, byocitin and horseradish peroxidase from the Gb and Rn is employed to reveal the neurons innervating these digestive regions which are located in all ganglia within the viscera-parietal ganglia complex. Although we observed the presence of a network of four ganglia: stomatogastric, gastric, cardic and pyloric, interconnected by nerves and located outer the surface of the stomach, which in the present study was referred to as the stomatogastric nervous system (STNS). Anterogradely labelin with Lucifer yellow which fibers of the STNS project to the submucous (SP) and myenteric plexuses (MP). The morphology of the enteric nervous system (ENS) was described using silver diammine impregnation and methylene blue staining. These plexuses were formed by extensive axonal networks and by several neuronal somata which are arranged in small clusters or as isolated cells. The axonal fibers innervating the longitudinal muscle cells in the stomach wall are organized in small bundles along the muscle length. The MP is distributed throughout the circular and longitudinal muscular layer. In the stomach, the cardic area plexus is denser than the pyloric plexus, while the nervous fibers of both are located between and around the muscular bundles The enteric plexus in the intestine is a continuity of the pyloric arrangement, staying uniform until the anus. In both typhlosoles of the pro-intestine nerve bundles are found in large numbers but none neuron is observed. In addition to the plexus were observed were observed neuron-like intraepithelial cells, which possess two types: open (a cilium projecting into the intestinal lumen) and closed (located at the base of the digestive epithelium) and fusiform cells whose morphology and position resembling interstitial cells of Cajal. The chemical neuroanatomy of the STNS and SNE was analyzed by histochemistry and immunohistochemistry methodos for different mediators and transmitters. In the midgut and hindgut, the plexus have a very intense AChE activity and it was constituted by fibers originated from the STNS or from the subesophageal complex through peripheral nerves. The enteric neurons and fibers with AChE activity were scattered in the submucosa and between the circular and longitudinal muscle layers of the stomach, intestine and rectum. Neuronal bodies and fibers with NADPHd activity are more abundant in the entire mass of smooth muscle elements than the submucosal layer. Fluorescent induced by GA revealed the presence of catecholaminergic nerve fibers and varicosities in the submucosal layer of the rectum, gizzard and post-intestine than in others organs of the GIt. The immunoreactivity to serotonin (5HTir) elements was predominantly distributed in the submucosal layer of the intestine and rectum. Few 5HTir fibers was verify in the proventricle and gizzard The FMRFa-immunoreactive elements were present in the mucosal, submucosal and muscular layers throughout the mid and hindgut. The neuron-like intraepithelial cells were more labeled by AChE, 5HT and FMRFa than for NADPHd and their processes were organized forming a subepithelial plexus. The bodies and processes of the fusiform cells were labeled by the methods applied extensions, except for the GA. It was found an intense glial fibrilary acidic protein immunorreaction (GFAP-ir) were visualized, throughout the midgut and hindgut plexuses and in the ganglia of the STNS. This intense immunoreaction to GFAP in intramural plexuses suggests important roles to glial cells in the peripheral nervous system of digestive tract of this pulmonate snail. Therefore, the gastrointestinal tract is controlled directly by extrinsic innervation from the subesophageal ganglia or indirectly via STNS (for the midgut) and by an intrinsic innervation, represented by the MP and SP for both mid and hindgut. The data obtained from the neurochemical approaches utilized in the GIt we infer that these different transmitter systems could exert putative roles in the motility or the secretomotor or sensorial functions of GIt. Finally, as an evidence of the enteric glial cells, the neural constituents of the snail GIt wall have a interaction with glia similar to have been described to invertebrate CNS represent a new approach to study of the ENS in gastropod and other invertebrates.