Efeito do envelhecimento sobre a atividade de secretases e o perfil de exossomos circulantes : modulação pelo exercício físico

Abstract

As vias amiloidogênica e não-amiloidogênica, representadas pelas enzimas secretases como a enzima clivadora do sítio beta da APP (BACE) e a enzima conversora do fator de necrose tumoral-alfa (TACE) respectivamente, são responsáveis pela clivagem da proteína precursora amiloide (APP). Alterações no processamento da APP associadas ao acúmulo do peptídeo β-amiloide (Aβ) parecem estar relacionadas aos déficits cognitivos observados na doença de Alzheimer (DA), no entanto, estudos avaliando a maquinaria de processamento da APP durante o envelhecimento fisiológico são raros. O Aβ é formado através da clivagem da proteína precursora amiloide (APP) pela enzima BACE. Por outro lado, a APP pode ser clivada por secretases como a TACE gerando APPα, o qual é considerado neuroprotetor. Alguns estudos têm sugerido um envolvimento de vesículas denominadas exossomos no transporte de proteínas como o peptídeo Aβ além de um papel dos exossomos durante o estresse oxidativo e no processo de envelhecimento. No entanto, estudos avaliando a relação entre exossomos e marcadores oxidativos no envelhecimento ainda não foram realizados. Além disso, apesar de diversas evidências demonstrarem os efeitos benéficos do exercício físico, os efeitos exercidos sobre a modulação da atividade das secretases, especificamente TACE e BACE, e sobre o perfil dos exossomos durante o envelhecimento fisiológico têm sido pouco investigados. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do exercício físico sobre a atividade das secretases e sobre o perfil de exossomos circulantes em ratos durante o envelhecimento. Ratos Wistar de 3, 21 e 26 meses de idade foram divididos em sedentários e exercitados, o protocolo de exercício consistiu em 20 min/ dia durante 14 dias e após a última a sessão de exercício todos os animais foram submetidos ao teste da esquiva inibitória. As estruturas cerebrais e o sangue troncular foram coletados 1h (período da tarde) e 18 h (período da manhã) após a última sessão de exercício com o objetivo de avaliar os efeitos transitórios e tardios do protocolo de exercício. O hipocampo e o córtex pré-frontal foram dissecados e utilizados para quantificar o conteúdo de APP e avaliar a atividade das enzimas TACE e BACE. Os exossomos foram isolados do soro e utilizados para quantificar CD63, atividade da acetilcolinesterase (AChE), conteúdo de espécies reativas, atividade da superóxido dismutase (SOD) e conteúdo de Aβ. Ratos envelhecidos demonstraram um prejuízo na memória aversiva assim como uma redução na atividade da TACE comparada aos animais adultos jovens. A atividade cortical da BACE aumentou no período da tarde nos animais de 26 meses de idade, no entanto, permaneceu inalterada assim como o conteúdo de APP no hipocampo de todos os grupos. Além disso, uma diminuição na razão TACE/BACE foi observada em animais envelhecidos. Adicionalmente, foram observados níveis diminuídos de CD63 e um aumento na atividade da AChE em exossomos circulantes de animais de 21 e 26 meses de idade. Altos níveis de espécies reativas foram detectados em exossomos de animais envelhecidos. O exercício físico foi capaz de melhorar o desempenho dos animais de todas as idades no teste da esquiva inibitória. Por outro lado, a atividade das secretases não foi alterada pelo protocolo de exercício físico utilizado. Em relação aos exossomos, o exercício físico foi capaz de aumentar os níveis de CD63 em todas as idades avaliadas. Foram observados níveis reduzidos de espécies reativas em exossomos de animais exercitados de todas as idades além de uma redução na atividade da AChE em exossomos de animais envelhecidos exercitados. Nossos resultados sugerem uma relação entre redução da atividade da TACE e declínio na memória aversiva em animais envelhecidos. Além disso, um desequilíbrio entre as vias amiloidogênica e não-amiloidogênica pode contribuir com a suscetibilidade das regiões corticais e hipocampais às doenças neurodegenerativas. Podemos inferir que o envelhecimento é capaz de alterar o perfil dos exossomos, assim como níveis aumentados de espécies reativas em exossomos circulantes de ratos de 21 e 26 meses podem desempenhar um importante papel no estado oxidativo relacionado ao envelhecimento. Adicionalmente, é possível sugerir que a redução nos níveis de espécies reativas em exossomos circulantes pode contribuir com os efeitos protetores do exercício físico durante o processo de envelhecimento.

The amyloidogenic and non-amyloidogenic pathways, represented by secretases named β-site APP cleaving enzyme(BACE) and tumor necrosis factor-alpha converting enzyme (TACE), respectively, are responsible for amyloid protein precursor (APP) processing. APP cleavage modifications leading to increased β-amyloid (Aβ) peptide levels seem to be related to cognitive decline observed in Alzheimer disease (AD), however, works evaluating the APP processing machinery in the normal aging process are rarely studied. The Aβ is formed through APP cleavage by BACE enzyme, named amyloidogenic pathway. On the other hand, APP can be cleaved by a non-amyloidogenic pathway through secretase enzymes such as TACE producing APPα, which is a neuroprotective product. Some evidences suggested that extracellular vesicles named exosomes could carry proteins including the Aβ peptide between different cells. Yet, exosomes appear to be linked to oxidative stress and aging process. However, studies evaluating the relationship between exosomes and oxidative stress marks in the aging were not yet performed. The beneficial exercise impact in the aging process are widely described, nevertheless, its effects on secretase activities, specifically BACE and TACE, and exosome profile during normal aging remains understood. Therefore, the aim of this study was to evaluate the exercise effects on secretase activities and circulating exosomes profile in the aging process. Wistar rats (3-, 21- and 26-month-old) were divided into sedentary and exercised groups; the exercise protocol consisted in a daily moderate treadmill exercise (20 min each day during 2 weeks). After the last exercise sessions, all animals were subjected to inhibitory avoidance task. To identify transitory and delayed exercise effects, specifically 1 and 18 hours after the last exercise training session, hippocampi and prefrontal cortices as well as blood were obtained at different times of day, respectively, in the afternoon and early morning. The brain areas were used to quantify the APP content and BACE and TACE activities. The circulating exosomes were isolated from serum and used to quantify CD63, reactive species and Aβ content, besides AChE and superoxide dismutase (SOD) activities. Aged rats exhibited impaired aversive memory performance and reduced TACE activity compared to young adult rats. TACE activity also was reduced in hippocampus of 26-month-old rats. Cortical BACE activity was higher in the afternoon in the oldest-old group (26-month-old rats), while hippocampal BACE activity and APP content were unchanged in all groups. Additionally, decreased levels of CD63 and increased AChE activity were observed in circulating exosomes of 21 and 26-month-old rats. It was demonstrated that aged animals present high free radical levels. The step-down latency in inhibitory avoidance was increased by exercise at all tested ages. Exercise reduced peripheral exosomal reactive species content in all tested ages besides to reduce AChE activity in exercised aged rats. Our results suggest a relationship between decreased cortical TACE activity and aging-related aversive memory decline. An imbalance between BACE and TACE activities, indexes of amyloidogenic and non-amyloidogenic pathways, was found in both tested brain areas suggesting a higher vulnerability to neurodegenerative disorders induced by aging. Moreover, it is possible suggest that the normal aging process can alter circulating exosomal profile; as well as increased reactive species levels found in peripheral exosomes of aged rats can play a crucial role in the oxidative status associated to aging. Additionally, we can suppose that reduced reactive species levels in circulating exosomes can contribute to beneficial exercise effects in the aging process.