Avaliação do perfil transcricional de genes relacionados à absorção e homeostase de ferro em Paenibacillus riograndensis SBR5

Abstract

Para as bactérias, ass1m como a ma1ona dos organismos v1vos, o ferro é um elemento essencial em muitos processos celulares. Embora o ferro seja abundante na crosta terrestre, ele não está prontamente disponível para os organismos. Para garantir a demanda e evitar a toxidez, os organismos desenvolveram vários mecanismos fisiológicos para lidar com mudanças na disponibilidade de ferro. Essa regulação fisiológica refinada é alcançada, principalmente, por mudanças na expressão de genes relacionados ao transporte e metabolismo do ferro. Apesar da sua importância, o metabolismo do ferro ainda é pouco compreendido em bactérias, especialmente em bactérias Gram-positivas. O gênero Paenibacillus contém mais de 30 espécies anaeróbicas facultativas, formadoras de endósporos, neutrofílicas, periflageladas heterotróficas, com baixo teor de C+G e Gram-positivas. A linhagem SBR5 de P. riograndensis foi isolada da rizosfera de Triticum aestivum (trigo), cultivado no Rio Grande do Sul, Brasil. Fixa nitrogênio e produz ácido-3- indol-acético, duas características importantes para bactérias promotoras do crescimento vegetal. Neste trabalho, culturas de P. riograndensis foram submetidas a condições de suficiência e deficiência de ferro. Surpreendentemente, P. riograndensis mostrou-se muito resistente à deficiência de ferro. O sequenciamento de RNA (RNA-seq) foi a metodologia utilizada para elucidar os mecanismos globais envolvidos na resistência de SBR5 à deficiência de ferro. Por esse método observou-se que a deficiência de ferro causou diversas mudanças na expressão gênica. Dos 150 genes diferencialmente expressos, 71tiveram a sua expressão induzida e 79 foram reprimidos. Oito genes cuja expressão foi pelo menos duas vezes maior ou menor na condição limitante, quando comparada à suficiência de ferro, foram escolhidos para análise por RT-qPCR, para validar os dados obtidos com RNA-seq. Em geral, a maioria dos genes apresentou o mesmo padrão de expressão após 24 h. Os resultados sugerem que, durante a deficiência de ferro, as bactérias expressam vários genes relacionados à absorção de nutrientes, a fim de obter todas as moléculas necessárias para manter os principais processos celulares. Porém, quando o ferro se torna altamente limitante e não existem mais condições adequadas para o crescimento exponencial, a bactéria começa a expressar, de forma antecipada, genes relacionados à formação de esporos, a fim de resistir a essa adversidade. Outro resultado importante foi que a metodologia escolhida se mostrou adequada para a descoberta de novos genes e a técnica de RT-qPCR foi eficiente na validação dos dados obtidos por RNA-seq e pode ser utilizada como alternativa para organismos em que não existem microarranjos disponíveis.

For bacteria, as most living organisms, iron is an essential micronutrient to many cellular processes. Although iron is abundant in crustal, it is not readily bioavailable for organisms. To ensure demand and avoid toxicity, organisms have developed several physiological mechanisms to address changes in iron availability. This tight physiological regulation is achieved mainly through the differential expression of genes related to iron uptake and metabolism. Despite its importance, iron metabolism is still poorly understood in microorganisms, especially in Gram-positive bacteria. The genus Paenibacillus contains more than 30 species of facultative anaerobic, endospore-forming, neutrophilic, periflagellated heterotrophic, and low C+G Gram-positive bacilli. The Paenibacillus riograndensis SBR5 strain was isolated from Triticum aestivum (wheat) rhizospheres in Rio Grande do Sul, Brazil. lt fixes nitrogen and produces indol-3-acetic-acid, two important plant growth promoting factors. In this work we submitted P. riograndensis cultures to iron sufficiency and deficiency conditions. Surprisingly, P. riograndensis was very resistant to iron starvation. RNA-sequencing (RNA-seq) was the technology used to elucidate the global mechanisms involved in SBR5 iron-starvation resistance. Through this methodology we observed that iron deficiency caused several changes in gene expression. From 150 differentially expressed genes, 71 were up- and 79 were down-regulated. Eight genes for which expression was at least twice as high (induced) or twice as low (repressed) in the iron-limited conditions compared with iron-sufficient conditions were chosen for RT-qPCR analysis to validate the RNA-seq data. In general, most genes exhibited the same pattern of expression after 24 h. Our results suggest that during iron deficiency, the bacteria express several genes related to nutrient uptake to obtain ali of the molecules necessary to maintain major cellular processes. However, once iron becomes highly limiting and is no longer able to sustain exponential growth, the bacteria start to express genes related to the sporulation process in the anticipation of spore formation as a way to resist this stress. Another important result was that RNA-seq methodology was suitable to the discovery of new genes and RT-qPCR is a good technique to validate RNA-seq data, especially for organisms for which microarrays are not available.