Análise molecular do gene PAH em pacientes com fenilcetonúria e uma abordagem estrutural da enzima fenilalanina hidroxilase

Abstract

A fenilcetonúria (PKU) é o erro inato do metabolismo dos aminoácidos mais comum e caracteriza-se por elevadas concentrações de L-fenilalanina no sangue devido a deficiência da enzima fenilalanina hidroxilase (PAH). A PAH é composta por monômeros divididos em três domínios: de regulação, catalítico e de tetramerização. Os objetivos do presente trabalho foram identificar as mutações no gene PAH responsáveis por PKU em pacientes do sul do Brasil e analisar o comportamento da PAH nas formas de monômero, dímero e tetrâmero. A amostra foi composta por 44 pacientes não aparentados. As mutações comuns foram analisadas por PCR em tempo real (sistema TaqMan®) e através de análise por RFLP. Os pacientes que, após a triagem para as mutações comuns, não tiveram seu alelos mutantes definidos, foram submetidos ao sequenciamento direto do gene PAH. Um modelo do monômero da PAH foi construído através do programa Modeller 9v7 para as análises in silico. A montagem do dímero e do tetrâmero da enzima foi realizada no programa PyMOL 1.1 e a simulação de DM coarse-grained pelo pacote de programas GROMACS 4.0. A aplicação conjunta das técnicas para identificação de mutações no gene PAH permitiu a definição de 83 alelos mutantes (94,3%) do total de 88 alelos estudados e a identificação do genótipo de 40 (90,9%) dos 44 pacientes incluídos neste trabalho. Os resultados obtidos contribuem com o perfil de mutações na população do sul do Brasil e indicam que o mesmo é representado por poucas mutações frequentes e um número maior de mutações raras. O perfil da trajetória dos monômeros durante a simulação nas estruturas propostas é diferente, principalmente pelo comportamento das α-hélices envolvidas na oligomerização da proteína. A α-hélice no monômero sofre compactação ao núcleo da proteína. A α-hélice no dímero apresenta alta flexibilidade mostrando que apenas duas α- hélices coordenadas não parecem suficientes para imobilizar este sistema e torná-lo rígido e estável, o que é observado na simulação da estrutura tetramérica quando quatro α-hélices estão coordenadas. Assim, mutações que impeçam a oligomerização da proteína podem formar estruturas mais instáveis que, como observado no monômero livre, podem iniciar um processo de agregação e serem enviadas a degradação rápida ou, somente por não atingirem conformação adequada, sejam encaminhadas a esta rota. Ambos aspectos abordados nesse trabalho contribuem para o melhor conhecimento do metabolismo normal e das alterações hereditárias relacionadas a fenilalanina hidroxilase.

Phenylketonuria (PKU), the most common inborn error of amino acids metabolism, is characterized by high levels of L-phenylalanine in blood due to deficiency of the enzyme phenylalanine hydroxylase (PAH). The PAH consists of monomers divided into three domains: regulatory, catalytic, and tetramerization. The aims of this study were to identify mutations in the PAH gene responsible for PKU in patients from South Brazil and to analyze the behavior of PAH as monomer, dimer, and tetramer. The sample for in vitro analyzes was composed by 44 unrelated patients. Common mutations were analyzed by qualitative Real time PCR (TaqMan® system) and by RFLP analysis. Patients with undefined mutant alleles after the screening for common mutations were submitted to direct DNA sequencing of the PAH gene. For in silico analyses a model of the PAH monomer was built through Modeller 9v7 program. The assembly of PAH dimer and tetramer was performed by PyMOL 1.1 program and the simulation of MD coarse-grained by package GROMACS 4.0. The combined approach for identifying mutations in the PAH gene identified of 83 mutant alleles (94.3%) of a total of 88 alleles and genotypes were defined in 40 (90.9%) of the 44 patients included in this work. Results show mutation profile where few mutations were present in the majority of mutant alleles while the remaining ones were rare sequence alterations. Considering in silico analyses, monomers trajectory profile of the monomers during the simulation in the proposed structures was different mainly by the behavior of α-helices involved in protein oligomerization. The α- helix in the monomer undergoes compression toward the protein core. The dimer α-helix presents high flexibility showing that only two α-helices coordinated do not seem to be sufficient to immobilize this system and make it rigid and stable, which is observed in simulation of the tetrameric structure when four α-helices are coordinated. Thus, mutations that prevent protein oligomerization can form these unstable structures in a higher level and they may initiate an aggregation process and be rapidly degraded or be conducted to this route by failing to achieve proper conformation. Both aspects addressed in this work contribute for a wider knowledge of normal metabolism and inherited alterations related to phenylalanine hydroxylase.