Caracterização da proteína prefenato desidratase de Mycobacterium tuberculosis H37Rv

Abstract

A tuberculose (TB) é uma das maiores causas de mortalidade em todo o mundo por um único agente infeccioso. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), todos os anos cerca de 8 milhões de pessoas são infectadas pelo Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da TB, e aproximadamente 2 milhões morrem em todo mundo. Desde a década de 80, o aumento da prevalência da TB em países em desenvolvimento, o aumento e a proliferação de cepas resistentes a múltiplas drogas, a falta de recursos públicos adequados para o tratamento e a alta incidência de pacientes infectados pelo HIV, destacou a necessidade de desenvolver novos agentes antimicobacterianos. A via do ácido chiquímico ou chiquimato está presente em bactérias, algas, fungos, plantas e parasitas do filo apicomplexa. Esta via leva a biossíntese de corismato, um importante precursor metabólico de ácido fólico, menaquinonas, micobactinas e aminoácidos aromáticos. A primeira reação na biossíntese de fenilalanina é catalizada pela corismato mutase e involve a conversão de corismato a prefenato. A segunda reação é catalisada pela prefenato desidratase que realiza a descarboxilação e desidratação de prefenato a fenilpiruvato. As enzimas presentes na via do chiquimato e biossíntese de fenilalanina parecem ser essenciais ao M. tuberculosis, o que as torna promissoras como alvo para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. O gene pheA que codifica a enzima prefenato desidratase (PDT) foi amplificado por PCR do DNA genômico, clonado em vetor pET23a(+) e superexpresso em células E.coli BL21(DE3). A proteína recombinante foi purificada por FPLC e a cristalização foi realizada pela técnica de difusão de vapor “hanging drop”. Os primeiros cristais apareceram sete dias após as gotas terem sido feitas. Cristais difrataram a 3.2 Å de resolução usando uma fonte de radiação síncrotron e pertencem ao grupo orthorrombico I222 ou I212121. Análise da estrutura por substituição molecular foi realizada, contudo os resultados não foram satisfatórios. Assim, outras ferramentas foram utilizadas para inferir a estrutura da PDT. A técnica de modelagem molecular foi usada para inferir a estrutura tridimensional da PDT. Dicroísmo circular e ferramentas de bioinformática mostraram resultados similares quanto à estrutura secundária, sendo formada por 33% de hélices alfas e 18% de fitas betas. Dessa maneira, técnicas de espalhamento de raios X a baixo ângulo somado com ultracentrifugação analítica mostraram que o estado oligomérico da PDT é um homotetrâmero e com forma de um disco achatado. Dinâmica molecular demonstrou que o modelo predito é estável durante uma trajetória de 6ns. Dados experimentais e ferramentas de bioinformática corroboram os resultados aqui apresentados, dando evidências da estrutura tetramérica da PDT em solução. Além disso, este é o primeiro relato da caracterização estrutural da PDT de M.tuberculosis.

Tuberculosis (TB) is one of the major causes of deaths worldwide from an infectious agent. According to the World Health Organization (WHO), every year 8 million people are infected by Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, and approximately 2 million people died in the world. Since 1980’s the increasing of prevalence of TB in developing countries, the emergence and proliferation of multidrug-resistant and extensively drug resistant strains, the lack of adequate public resources for treatment and the high incidence of HIV-infected populations have highlighted the need for developing new antimycobacterial agents. The shikimate pathway is present in mycobacteria and absent in algae, plants, fungi and parasite of the phylum apicomplexa. This pathway leads to the biosynthesis of chorismate, an important metabolic precursor of folic acid, menaquinones, mycobactinas and aromatic amino acids. The first reaction in phenylalanine biosynthesis is catalysed by chorismate mutase and involves the conversion of chorismate to prephenate. The second reaction is catalysed by prephenate dehydratase and involves the decarboxilation and dehydratation of prephenate to phenylpiruvate. The enzymes of this pathway seem to be essential to M. tuberculosis and can thus be used as targets for the development of new antimycobacterial drugs. The pheA gene that encodes to prephenate dehydratase (PDT) was amplified by PCR from genomic DNA, cloned in pET23a(+) and overexpressed in E. coli BL21(DE3). The recombinant protein was purified by FPLC, and crystallization was performed by the hanging drop vapor diffusion method. Crystals appear seven days after drops were done. The crystal diffracted at 3.2 Å resolution using a synchrotron radiation source and belong to the orthorhombic group I222 or I212121. Molecular replacement was used to solve the structure of PDT, but did not yield meaningful results. Other tools were used to infer the structural arrangement of PDT. Molecular modeling were used to infer the three dimensional structure of PDT. Circular dicroism and bioinformatics tools were in agreement in about secondary structure, showing 33% of -helix e 18% of beta sheet. Small Angle X-Ray scattering and analytical centrifugation showed that the oligomeric state of this protein is a homotetramer and the PDT is a flat disk protein. Molecular dynamics showed that this model is stable at a trajectory of 6ns. Experimental and bioinformatics tools were in agreement and provide evidence for a tetrameric structure of PDT at solution. Therefore, this is the first report of a structural characterization of PDT from M.tuberculosis.