Análise do transcritoma de Anthonomus grandis e avaliação de um gene com potencial aplicação para controle do inseto por silenciamento gênico

Abstract

O algodoeiro sofre o ataque de diversos insetos-praga, sendo o principal o bicudodo- algodoeiro (Anthonomus grandis). Visando alternativas mais eficazes para o controle de insetos, tem-se buscado a transgenia de plantas, por meio da introdução de genes que codificam moléculas entomotóxicas. Entre as diferentes estratégias de engenharia genética utilizadas para controle de insetos-praga, a estratégia envolvendo o silenciamento gênico, pelo uso da interferência mediada por RNA (RNAi), é atualmente bastante promissora e de grande relevância. O trabalho aqui apresentado resultou na geração de uma biblioteca completa de genes expressos de A. grandis, por meio de sequenciamento completo de ESTs, obtidas a partir de diferentes estágios do desenvolvimento do inseto. O pirosequenciamento do transcritoma de A. grandis gerou mais de 500.000 reads e um banco de dados com 20.841 contigs com alta qualidade. Após a montagem e anotação das sequências foram realizadas buscas por genes essenciais do inseto, candidatos ao silenciamento por RNAi. Um desses genes, que codifica a enzima lacase2, foi selecionado e avaliado, mostrando alto potencial para o controle do bicudo do algodoeiro. Esta enzima faz parte do processo de formação e esclerotização da cutícula do inseto. Sua expressão se mostrou quantitativamente maior nas fases mais tardias do ciclo de vida do inseto. Observou-se que a expressão relativa dos transcritos de lacase2 foi altamente reduzida e o desenvolvimento do inseto foi afetado pelo silenciamento gênico. Além da validação do gene de lacase2 para potencial controle do bicudo, este trabalho disponibiliza dados para a escolha de genes de referência para experimentos de quantificação relativa de transcritos por PCR em tempo real em várias partes de larvas e adultos de A. grandis. O conjunto de dados aqui obtidos poderá contribuir enormemente para o agronegócio brasileiro e será de grande importância para a obtenção e geração de eventos de algodão transgênicos resistentes ao bicudo do algodoeiro.

Cotton plants are subjected to the attack of several insect pests. In Brazil, the cotton boll weevil Anthonomus grandis is the most important cotton pest. The use of transgenic plants by introducing genes coding for entomotoxic molecules is one of the recent efficient approaches used in plant pest control. Among those, the use of gene silencing by interference RNA (RNAi) as a technique for insect control is very promising. The work presented in the next pages shows the use of pirosequencing technique for the construction of a cDNA library formed by A. grandis expressed genes in all developmental stages of the insect. The pirosequencing of A. grandis transcriptome resulted in more than 500,000 reads and a data set of high quality 20,841 contigs. After sequence assembly and annotation, the library was screened for insect essential candidate genes for RNAi-mediated gene silencing. One gene, coding for the enzyme laccase2 was selected and has demonstrated high potential for insect control. This enzyme is involved in insect cuticle formation and sclerotization, and the gene was found to be more expressed in the insect pupa and adult developmental stages. Insect development was affected by gene silencing and the relative expression of laccase2 transcripts was highly decreased. Moreover, this work provides data for choosing reference genes to be used in qPCR experiments for several parts of boll weevil larvae and adult organism. The results provided in this work may contribute to Brazilian agribusiness by the potential important generation of genetically modified cotton plants with significant resistance to cotton boll weevil.