Influência de mecanismos de resposta a danos no DNA na resistência de células de leucemia ao antineoplásico Mitoxantrona

Abstract

A quimioterapia é uma das principais estratégias no tratamento do câncer. No entanto, muitos tumores apresentam resistência, tornando o tratamento parcial ou totalmente ineficaz. Existem alguns mecanismos que podem estar relacionados ao desenvolvimento desse perfil de resistência, sendo o mais estudado o aumento do efluxo das drogas através de proteínas de membrana celular. Por outro lado, uma alteração nas vias de reparo de DNA também contribui para a resistência tumoral, uma vez que as lesões são removidas antes mesmo de se tornarem citotóxicas para as células, reduzindo assim a efetividade do quimioterápico. Dentre as vias de reparo de DNA, a via do Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER) é uma das mais versáteis, e há estudos que demonstram seu envolvimento em resposta às lesões geradas por antraciclinas. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a contribuição dos mecanismos de resposta à dano no DNA, bem como da via NER, na resistência à Mitoxantrona (MXT), um análogo de antraciclinas, na linhagem celular de leucemia HL-60/MX2. Para isso, analisou-se a sobrevivência celular, pelo método de exclusão por azul de tripan, o perfil de ciclo celular e a fosforilação da histona H2AX (γH2AX), por citometria de fluxo, além da análise de expressão gênica da via NER e proteínas de efluxo por qPCR. Os resultados indicam um perfil de resposta diferente entre a linhagem resistente e a linhagem sensível, observado pelo teste de sobrevivência e pelos diferentes perfis de ciclo celular e fosforilação de H2AX. Além disso, a análise de expressão gênica demonstra um aumento na expressão de genes da via NER, como ERCC1 já antes do tratamento e XPA após os tratamentos, na linhagem resistente. Estes resultados demonstram portanto envolvimento desta via de reparo de DNA na resistência tumoral da linhagem HL- 60/MX2.

Chemotherapy is one of the main cancer treatment strategies; however, tumors can show resistance, which makes the treatment partial or totally inefficient. Among the mechanisms that may be related to the resistant profile, the most studied is increased drug efflux through ABC transporter permeases. On the other hand, altered DNA repair pathways may contribute to cancer resistance, since the lesions are removed before they become toxic to cells, which reduces chemotherapy effectiveness. Among DNA repair pathways, Nucleotide Excision Repair (NER) is one of the most versatile, and there are studies showing its involvement in removal of anthracyclines-induced lesions. Thus, our aim was to evaluate the contribution of DNA damage response mechanisms, focusing on NER, to the resistance to Mitoxantrone (MXT), an anthracycline analog, using the mitoxantrone-resistant leukemia cell line HL-60/MX2 as a model. After treatment with MXT and Etoposide (ETO), a topoisomerase II inhibitor, cell survival was assessed by trypan blue exclusion method; cell cycle profile and H2AX histone phosphorylation (γH2AX) were evaluated by flow cytometry; and gene expression levels of NER and efflux proteins were determined by RT-qPCR. Results indicate a different response between the resistant HL-60/MX2 and the sensitive HL-60 cells, as observed in the survival assay, cell cycle, and H2AX phosphorylation profile. Furthermore, in the resistant cells, RTqPCR analysis showed an increase in the expression of NER genes, with ERCC1 expression increased before treatments, and XPA after the treatments. Therefore, our results indicate the contribution of NER machinery in the resistance of leukemia cells to Mitoxantrone.