Caracterização molecular das mutações em pacientes com hemofilia B

Abstract

A Hemofilia B (HB) é uma doença hemorrágica causada pela redução ou ausência da atividade do Fator IX da coagulação (FIX), devido a mutações no gene que codifica a proteína. O padrão de herança é recessivo ligado ao sexo. O FIX ativado, em complexo com o fator VIII (FVIII) ativado, forma o complexo Xase intrínseco, o qual leva à ativação do fator X (FX). O FX ativado transforma a protrombina em trombina, a qual converte fibrinogênio em fibrina, formando o coágulo sanguíneo. O gene do FIX localiza-se no cromossomo Xq27.1, ele compreende 33kb e está organizado em 8 éxons (a-h). Existem 1.094 mutações descritas que resultam em hemofilia B nas formas grave, moderada ou leve, sendo que mais da metade dessas mutações estão associadas à forma grave da hemofilia B. O presente estudo tem por objetivo geral a caracterização molecular das mutações em pacientes diagnosticados com hemofilia B residentes no Rio Grande do Sul. Esse estudo das mutações possibilita uma melhor compreensão da genética molecular da doença na população estudada; fornece ferramentas importantes para análises bioquímicas e predição de alterações na estrutura tridimensional da molécula do FIX e melhora o entendimento da relação genótipo/fenótipo. Um total de 52 pacientes masculinos com hemofilia B está incluído no estudo. A estratégia utilizada para a detecção de mutações na hemofilia B foi iniciada pela investigação da presença de grandes deleções, utilizando-se a técnica de PCR. Não foram encontradas, porém, quaisquer grandes deleções. A seguir, foi feito o sequenciamento direto dos 8 éxons do gene do fator IX e suas regiões flanqueadoras. Os produtos de PCR foram purificados para o sequenciamento e, após, essas amostras foram encaminhadas a uma empresa terceirizada para o sequenciamento. Serão apresentados resultados dos éxons 1 a 8, nos quais foram encontradas 19 diferentes mutações, sendo 15 mutações de sentido trocado, 1 pequena deleção de dois nucleotídeos e 3 mutações sem sentido. Esses resultados foram comparados com as informações existentes no banco de dados mundial e estudos específicos anteriores desenvolvidos no Brasil, Argentina e México.

Hemophilia B (HB) is a hemorrhagic disorder caused by the reduction or absence of activity from the coagulation Factor IX (FIX), due to mutations in the protein encoding gene. The pattern of inheritance is sex-linked recessive. The activated FIX, along with the activated Factor VIII (FVIII), originates the intrinsic Xase complex, which leads to the activation of Factor X (FX). The activated FX transforms prothrombin into thrombin, which converts fibrinogen into fibrin, resulting in blood clot. The FIX gene is located on chromosome Xq27.1, comprises 33kb and is arranged in 8 exons (a-h). There are 1,094 described mutations that result in Hemophilia B in its severe, moderate or mild forms, and more than half of these mutations are associated with Hemophilia B’s severe form. The overall purpose of the present study is to present the molecular characterization of mutations in patients diagnosed with Hemophilia B who are residents in Rio Grande do Sul. This study on mutations allows a better understanding of molecular genetics of the disease in the analyzed population; it also provides important tools for biochemical analyses and for the prediction of changes in the three-dimensional structure of the FIX molecule, and it improves the understanding of the genotype/phenotype relationship. A total of 52 male patients diagnosed with Hemophilia B, is included in the study. The strategy used to detect mutations in Hemophilia B was first to examine the presence of major deletions, using PCR methods. No large deletions, however, were found. Afterwards, we performed the direct sequencing of the 8 exons of the Factor IX gene and its flanking regions. The PCR products were purified for the sequencing process, and then these samples were sent to a third-party company for sequencing. The results for exons 1 to 8 are presented; we found 19 different mutations, from which 15 are missense mutations, 1 is a small deletion of two nucleotides and 3 are non-sense mutations. These results were compared with those of the world database and specific previous studies performed in Brazil, Argentina and Mexico.