Produção, purificação e caracterização de xilanases (EC 3.2.1.8) excretadas por isolados amazônicos de Bacillus em cultivo semi-sólido

Abstract

A xilanase ( 1 , 4 -B - xilanahidrolase,EC, 2.2.1.8) é a principal constituinte do sistema enzimático XilanolÍtico microbiano. Ela tem sido extensivamente estudada e empregada em vários processos biotecnológicos, podendo ser produzida tanto em cultivo semi-sólido (CSS) quanto em cultivo submerso (CSm), com prevalência deste último.No entanto, nos úItimos anos o interesse no CSS para produção de enzimas tem aumentado, em virtude das inúmeras vantagens econômicas e de engenharia que este oferece. Neste trababalho, objetivou-se aumentar o conhecimento existente sobre a produção e as aplicações de xilanases bacterianas. Uma xilanase livre de celulases produzida por um isolado amazônico de Bacillus coagulans em CSS utilizando um abundante resíduo fibroso de soja foi identificada e o seu potenciai para biobranqueamento de polpa Kraft foi demonstrado. Outra xilanase produzida em CSS pelo Bacillus circulans BL 53 também foi identificada. Através do emprego de ferramentas de planejamento experimental determinou-se que as melhores condições para a produção dessa enzima são tempos de cultivo e aerações moderadas (5 dias e 500 rnL.mK1) e tem* baixas (25C),com as quais foi possivel aumentar a produção da enzima em 2,5 vezes, em relação ao que era obtido nas cundições anteriormente empregadas. Também investigou-se, através de metodologias de planejamento experimental , as melhores condições para extração da xilanase produzida em CSS. Os resultados indicam que a extração da enzima foi máxima quando utilizou-se água a 7OC como solvente, por 40 minutos, 1 50 rpm e uma relação de sólidos/líquidos de 1 :6.A enzima foi purificada á homogeneidade por precipitaqão fracionada com sulfato de amônio, cromatografia de troca catiônica e gel filtração. Uma purificação de 428 vezes fói alcançada, apresentando uma atividade específica de aproximadamente 37 umg-' de proteína. O peso molecular da enzima foi determinado por SDS-PAGE, sendo de aproximadamente 38 KDa. A máxima atividade enzimática foi determinada usando planejamento fatorial 22 e a enzima apresentou um ótimo de temperatua entre 40 e 80C e de pH entre 5,O e 8,O. Os resultados obtidos sugerem que as xilanases produzidas neste trababalho apresentam algumas propriedades interessantes para futuras aplicações industriais.

Xylanase (1,4-P-xylan xylanohydrokes, EC 3.2.1.8) is tke main constituent of microbiai xylanolytic enzyme systems. The y are extensively used in many biotechoIogical applications and have been produced in eitha solid-state (SSC) or submerged cultivations with the prevalence of the 1st om. However, SSC has gained renewed interest in recent years and has ohn been employed for the production of many enzyrnes due to a nurnber of ecomrnical and engineering advantages. In this work, an effort has been made in order to increase available knowlsdge about bactmial xylanases. A celluiase-free xylanase produd by an amazon Bacillu,s coagulap~sst rain on sulid-state cuitivation using an industrial fibrous soybean residue as substrate was identified and their biobleaching potential was showed. Another xylamse, produced by Bacillus eirculans BL 53 also was identified. A z3 central composite design (CCD) was applied to determine the optimal conditions of cultiwtion time, aeration and temperature to xylanase production by Bacilhs circulans BL53. The results suggest that xylahase production by tkis strain is higher at a moderate cultivation time and aeraíion (5 days and 500 m L . e l , respectively) and at low temperatures (25'C) and following CCD modeled conditions, it was possible to increase 2.5 fold enzyme activities previously obtahed and published by our group. The present work also dealt with the extmction optimization of xylanases produced in solid state cultivations of Bacilh circuluns, with the purpose of reducing enzyme losses in order to obtain crude exúacts as concentrated as possible. A 23 fáctorial design was performed to h d the best conditions of time, agitation and sulidlliquid ratio. Maximm recovery was obtained by extmchg in water at 7 OC, 40 minutes, 150 rpm and 1 :6 soiidlliquid r&. This xylariase was purified to apparent homogeneity b y ammonium sulfate precipitation, cation-exchange chromato aphy and gel filtration. A 428-fold purification was achieved, with the purified xylanase f avitig a speciftc activity of about 3 7 JU.mg-' protein. The molmlar weight of the enzyme is about 38 Kda, as determined by SDS-PAGE. The m e - sictivity was obtained iising a 22 factorial design over a large range of temperam (40 - S K ) and pH (5.0 - 8.0). Results strongly suggest that the xylamses produced in this work exhibit some intetksting properties for indushd applications.