O Mecanismo de ação da ecteinascidina-743 e sua interação com a reparação do DNA

Abstract

A ecteinascidina-743 (ET-743) é um alcalóide marinho que tem apresentado potente atividade antitumoral contra uma variedade de tumores humanos, incluindo sarcomas, câncer de mama e de ovário. Em resposta aos resultados promissores que a ET-743 tem mostrado na clínica, o seu mecanismo de ação vem sendo amplamente investigado. Sabe-se que a ET-743 se liga na volta menor do DNA e influencia a dinâmica da hélice. Neste trabalho, o mecanismo de ação da ET-743 foi estudado em modelos eucarióticos de células da levedura Saccharomyces cerevisiae e em células de mamíferos, incluindo linhagens tumorais humanas. A utilização do modelo de levedura revelou que o sistema de reparação por excisão de bases está envolvido com o mecanismo de citotoxicidade da ET-743. Além disso, o emprego de mutantes de levedura permitiram explicar como ocorre a tolerância e a reparação dos danos gerados pela ET-743 nas linhagens que são resistentes à ação da droga. Além do mecanismo molecular proposto, este trabalho proporcionou uma possível explicação para a especificidade da ET-743 em tumores do tipo sarcomas. Considerando que a resistência dos sarcomas à maioria das drogas clássicas seja devido a superexpressão de APE1, entre outros fatores, e que a ausência desta proteína torna as células eucarióticas resistentes à ET-743, os resultados obtidos nesta tese contribuem para explicar por que sarcomas, tumores que superexpressam esta proteína, são sensíveis ao tratamento com ET-743. Além dos dados envolvendo o BER, este estudo permitiu explicar como ocorre o processamento da lesão gerada pela ET-743 no DNA. A utilização de linhagens celulares de mamíferos com deficiências em proteínas específicas combinado a técnicas bioquímicas e moleculares revelaram que a ET-743 forma adutos no DNA que são convertidos em uma lesão secundária durante a replicação do DNA. Pela primeira vez foi mostrado que a ET-743 induz a formação de quebras duplas dependentes de replicação e que o sistema de recombinação homóloga é responsável pela reparação destes danos. Os dados obtidos neste trabalho indicam que a funcionalidade das vias de reparação de DNA é uma ferramenta útil para predizer a resposta clínica da droga e, dessa forma, contribuir na seleção de pacientes que mais podem se beneficiar do tratamento.

Ecteinascidin 743 is a marine alkaloid that has shown potent antitumor activity against several human tumor types, including soft tissue sarcomas, breast and ovarian cancer. Because of these promising data, there is a strong interest in evaluating its mechanism of action. ET-743 binds to the minor groove of DNA and induces helix unwinding. Here, we studied its mechanism of action in both yeast Saccharomyces cerevisiae and mammalian cells, including human tumor cell lines. Using the yeast model, we have demonstrated that the base excision repair pathway is strongly involved in ET-743 cytotoxicity. Moreover, this work clarified how ET-743-induced DNA damages can be tolerated and repaired in yeast resistant cell lines. In addition to the molecular model we have suggested to explain the mechanism of action of ET-743, this work brings new insights to explain the specificity of ET-743 towards soft tissue sarcomas. Indeed, sarcomas, while resistant to most of the chemotherapeutic agents, over-express APE1. Thus, the involvement of APE1 in cell killing, could explain why sarcomas, as well as tumors expressing high levels of APE1, are sensitive to the treatment with ET-743. This work was extended to mammalian cells in order to better understand the processing of the ET-743-induced DNA damage. Molecular and biochemical experiments were combined and revealed that the primary ET-743 DNA-adducts is transformed in DNA double strand breaks, a secondary type of more toxic DNA lesion. This formation is entirely dependent on the progression of the DNA replication fork. The use of mammalian cell lines, deficient in specific repair proteins, demonstrated for the first time that these lesions were uniquely processed by the homologous recombination repair pathway. Thus, our data establish a new rational, based on the measure of the expression levels of selected repair fa ctors, both to predict clinical response and to facilitate the selection of the patients particularly likely, or not, to benefit from the treatment with ET-743.