Análise molecular de mutações freqüentes em pacientes com suspeita clínica de fibrose cística

Abstract

A fibrose cística (FC) é a doença autossômica recessiva mais comum em eurodescendentes, com uma incidência estimada em 1 caso em cada 2500 nascimentos. A fisiopatologia da FC reflete mutações no gene regulador da condutância transmembrânica da FC, denominado CFTR. A patologia dessa doença envolve o trato respiratório, o trato gastro-intestinal, o trato gênito-urinário e as glândulas sudoríparas. A morbidade e mortalidade ocorrem devido às infecções persistentes e recorrentes das vias aéreas. O diagnóstico é baseado na presença de características clínicas e evidência de disfunção no gene CFTR. Mais de 1500 mutações nesse gene já foram identificadas, o que torna o diagnóstico molecular bastante difícil. Porém, a mutação DF508 apresenta alta freqüência entre os eurodescendentes (66%). O objetivo deste trabalho foi implementar uma metodologia semiautomatizada para a detecção das mutações DF508, G542X, G551D, R553X e N1303K no gene CFTR utilizando PCR em tempo real através do sistema TaqMan® e aplicar a metodologia em uma população composta por pacientes que apresentam suspeita clínica de FC. A população foi composta por 190 pacientes e as freqüências alélicas encontradas foram as seguintes: 50,0% para a mutação DF508, 4,1% para a mutação G542X e 3,1% para a mutação N1303K. As mutações G551D e R553X não foram encontradas nessa amostra. Os genótipos encontrados foram: 14 DF508/DF508 (7,40%), 3 DF508/N1303K (1,60%), 2 DF508/G542X (1,05%), 1 G542X/G542X (0,50%), 27 DF508/? (14,20%), 2 N1303K/? (1,05%), enquanto 141 amostras (74,20%) não apresentaram as mutações estudadas. Dividindo a amostra em dois sub-grupos de acordo com a gravidade da suspeita clínica, no grupo com uma forte suspeita clínica, uma mutação foi identificada em 57,20% dos alelos (56/98) e os genótipos foram estabelecidos em 40,80% dos pacientes (20/49). Portanto, considerando os dois sub-grupos e suas respectivas freqüências alélicas, demonstramos claramente que uma forte suspeita clínica é essencial para aumentar a identificação de alelos mutantes. Concluindo, o PCR em tempo real proposto usando sondas de hibridização foi eficaz e simples de ser utilizado na rotina laboratorial para detectar mutações no gene CFTR. Além disso, esse sistema é potencialmente adequado para programas de triagem neonatal e outros programas de larga escala.

Cystic fibrosis (CF) is the most common autosomal recessive disease in euro-descendents, with an estimated incidence in 1 case in each 2,500 births. CF physiopathology reflects mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, named CFTR. Pathology of this disease affects respiratory tract, gastro-intestinal tract, genital tract, and sweat glands. Mortality and morbidity occur due to recurrent and persistent airways infections. Diagnosis is based on presence of clinical symptoms and evidence of dysfunction in the CFTR gene. Up to date, more than 1,500 mutations were already identified in this gene. However, DF508 mutation shows high frequency among euro-descendents (66%). The aim of this work was to introduce a semi-automated methodology to detect DF508, G542X, G551D, R553X, and N1303K mutation in the CFTR gene using real time PCR through TaqMan® system, and to apply this methodology in a population composed by patients with a clinical suspicion of CF. Methodology was applied to 190 patients, and determined allelic frequencies were: 50.0% for DF508 mutation, 4.1% for G542X mutation, and 3.1% for N1303K mutation. G551D and R553X mutation were not detected in this sample population. Genotypes defined were: 14 DF508/DF508 (7.40%), 3 DF508/N1303K (1.60%), 2 DF508/G542X (1.05%), 1 G542X/G542X (0.50%), 27 DF508/? (14.20%), 2 N1303K/? (1.05%), while 141 samples (74.20%) did not present mutations studied. Dividing this population into two subsets according to the strength of clinical suspicion, within group with a strong clinical suspicion a mutation was identified in 57.20% of alleles (56/98), and genotypes were defined in 40.80% of patients (20/49). Therefore, considering both subsets and their allelic frequencies, we clearly demonstrate that a strong clinical suspicion is essential to increase the identification of mutant alleles. In summary, the proposed real time PCR using hybridization probes was efficient and simple to be applied in the laboratorial routine to detect mutations in the CFTR gene. In addition, this system is potentially adequate to neonatal screening and other large scale programs.