Transcriptoma Global e de Genes Alvo da Rota de Biossíntese de Glicoalcalóides em Novas Variedades de Solanum tuberosum L.

Abstract

Batatas (Solanum tuberosum) juntamente com arroz, trigo e milho, são as culturas mais consumida no mundo. A inclusão de novas variedades de S. tuberosum para consumo humano e sob a forma de ração necessita avaliação quanto sua segurança. Normas internacionais citam glicoalcalóides (GA) como tóxicos-chave em avaliação de novas variedades de batatas. Portanto, o objetivo do trabalho foi propor um modelo de avaliação da segurança de novas variedades de batata, incluindo geneticamente modificados, baseado no transcriptoma e análise comparativa de variedades com histórico de segurança. Adicionalmente, pretendeu-se determinar genes referência para análise transcricional de tubérculos. E ainda, caracterizar os genes glycoalkaloid metabolism (GAMEs), que fazem parte da biossíntese de GA e relacionar sua expressão com o total de glicoalcalóides (TGA) em diferentes genótipos de tubérculos de batatas. Para tanto, construiu-se um banco de dados com RNAseq de 90 tubérculos de batatas com grande variabilidade genética e natural. O banco de dados também foi utilizado para ranquear candidatos a genes normalizadores, baseado no intervalo interquartil (IQR), que, posteriormente, tiveram sua estabilidade calculada pelo: geNorm, NormFinder e BestKeeper. O conteúdo de TGA foi medido em cromatografia líquida de alta eficiência com espectrômetro de massa (CLAE-EM) e a expressão dos GAMEs foi determinada por reação de transcriptase reversa quantitativa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-qPCR). Para análise da região promotora utilizou-se: Plant Pan – Plant Promoter Analysis Navigator. Através dos resultados obtidos e analisados, podemos afirmar que o modelo, quando devidamente validado e finalizado, pode ser considerado bastante promissor. Os genes C2, SEC3 e CUL3A foram considerados como excelentes normalizadores para tubérculos de batata. A expressão dos GAMEs foi maior em tubérculos com maior conteúdo de TGA, e com exceção do GAME7, os genes GAME4, GAME6, GAME8ab, GAME11 e GAME12 demonstraram ser estatisticamente (α = 0,05) mais expressos em amostras com maior teor de TGA e menos em amostras com menor TGA, confirmando a relação destes genes com a produção de glicoalcalóides. Na análise de fatores de transcrição dos GAMEs muitos elementos cis relacionados a estresse biótico e abiótico, e regulação por luz foram encontrados, além de muitas cópias desses elementos cis nas regiões promotoras de todos os GAMEs. Os resultados obtidos no presente trabalho são importantes para um melhor entendimento da formação e regulação dos GA em tubérculos de batatas, auxiliando na predição e prevenção de formação deste composto.

Potato (Solanum tuberosum) is the third most important food crop in the world after rice and wheat in terms of human consumption. The introduction of new varieties of S. tuberosum for food or feed requires the checking of not only substances of pro-nutritional functioning on the human body, but should examine the content of toxic compounds, such as glycoalkaloids (GA), as an international norm recommendation for new potatoes varieties evaluation, including genetic modified. For this reason, the goal of the present work was build a food safety assessment model based on transcriptomics, and comparative with history of safe human consumption. Besides, we intended to determined reference genes for transcriptional analysis of potato tuber, and characterized glycoalkaloid metabolism (GAME) genes that partake of GA biosynthesis pathway. The correlation between the expression of GAME genes and total glycoalkaloids (TGA) content in different genotypes of potato tubers was evaluated. To do so, a database was build with RNASeq data from 90 potato tubers with large genotype and natural variability. These database were also used to ranking the candidates to be reference genes based on Interquartile Range (IQR). The stability of candidates for reference genes were evaluated by geNorm, NormFinder and BestKeeper. The content of TGA were measured on high performance liquid chromatography acoplated on mass spectrometry (LC-MS). Later, Reverse Transcriptase quantitative Polymerase Chain Reactions (RT-qPCR) determined the expression of GAME genes. For the promoter region analysis of GAMEs were used “Plant Pan – Plant Promoter Analysis Navigator”. It is possible affirmed that the food safety assessment model after a properly validation will be promising. The best reference genes for transcriptional analysis studies of potato tubers were C2, SEC3 and CUL3A. The expression of GAME4, GAME6, GAME7, GAME8ab, GAME11, and GAME12 were higher in tubers with high TGA content, and, exception for GAME7, the other GAME genes demonstrate statically (α = 0,05) higher expression on samples with high TGA and lower on samples with low TGA content, confirming that there is a relation between GAME genes and GA biosynthesis. On transcription factors analysis of GAME genes several cis-elements related to abiotic and biotic stress, and light regulated were found, also many copies of these factors in all GAME promoter region. All these results are very helpful to better understand GA formation and regulation on potato tubers, helping to predict and prevent the formation of these toxic.