Avaliação da atividade anti-aspergillus do óleo essencial de Origanum vulgare L. In vitro e in vivo em frangos

Abstract

O Origannum vulgare L. (orégano) é uma erva com potencial terapêutico, havendo, entre seus extratos, maior atividade detectada no óleo essencial (OEO). Dentre os constituintes estudados neste extrato estão monoterpenos responsáveis por atividades farmacológicas, incluindo ação antibiótica sobre diversos organismos, entre os quais, Aspergillus spp, os mais importantes fungos em medicina veterinária. A aspergilose é a micose de maior morbimortalidade em aves, e a principal doença respiratória nesses animais. A espécie mais envolvida em casos clínicos é o A. fumigatus, devido principalmente à sua ampla capacidade de disseminação ambiental, ao reduzido tamanho de seus propágulos e à produção de metabólitos secundários. O tratamento da micose é considerado pouco eficiente, devido, entre outros fatores, ao número limitado de antifúngicos, à alta toxicidade destes fármacos, e à resistência por parte do Aspergillus spp. Em vista desta realidade o presente estudo objetivou avaliar o potencial terapêutico do OEO no tratamento e prevenção da aspergilose crônica experimental por A. fumigatus em frangos (Gallus gallus). Para tanto realizou-se, primeiramente testes de sensibilidade in vitro de Aspergillus spp. frente ao OEO; de toxicidade do óleo e desenvolvimento experimental de aspergilose em frangos. Os testes de sensibilidade in vitro foram ensaiados com A. fumigatus, A. flavus e A. niger, iniciando com OEO na concentração 900mg/mL (6%) passando por dez diluições seriadas com base log2. Foram realizados testes de toxicidade aguda sistêmica (24h de exposição) e toxicidade subcrônica sistêmica (30 dias de exposição) com OEO nas concentrações 225mg/mL (1,5%), 450mg/mL (3,0%) e 675mg/mL (4,5%). A infecção experimental foi realizada em três etapas, utilizando para tanto diferentes concentrações, volumes e números de inoculações. E tanto para tratamento quanto para profilaxia da aspergilose utilizou-se grupo tratado com OEO (O), com o antifúngico padrão itraconazol (I), com ambos os produtos associados (I+O), e grupo sem tratamento (C). A partir da análise química do óleo foram observados 15 diferentes compostos ativos, sendo 4-terpineol (18.4%), hidrato de sabinene (15,6%) e timol (13,6%), os componentes majoritários. No teste de sensibilidade in vitro o óleo essencial apresentou tanto atividade fungicida quanto fungistática frente a Aspergillus spp., com CIM variando entre 28,125mg/mL (0,1875%) e 450mg/mL (3,0%) e CFM entre 112,5mg/mL (0,75%) e 450mg/mL (3,0%). E CIM 50 de 112,5 mg/mL (0,75%) e CIM 90 de 450mg/mL (3,0%). Observouse que em todas as concentrações testadas, o óleo essencial de O. vulgare não causou nenhuma alteração clínica nem anatomopatológica. Para reproduzir aspergilose experimental crônica A. fumigatus em frangos de 15 dias definiu-se que deve-se utilizar concentração de 12x108 UFC/mL em três inoculações seriadas, com intervalos de 24h. O primeiro dia de infecção foi considerado o dia três. Na avaliação do uso d OEO para tratamento e profilaxia da aspergilose, I+O apresentou melhores resultados, com menos sinais clínicos, anatomopatológicos, microscópicos e menor contagem de Unidades Formadoras de Colônia/g/órgão. I e O apresentaram resultados, de forma geral, inferiores à I+O, porém superiores à C, não sendo possível avaliar qual grupo obteve maior eficácia no tratamento e/ou profilaxia da micose.

Origannum vulgare L. (oregano) is a herb with therapeutic properties. In its extract, higher activity is detected on the essential oil (OEO). Among the extract components are monoterpenes with pharmacological properties, e.g. antibiotic action over several microorganisms, including Aspergillus spp., which are fungi of great importance in veterinary medicine. Avian aspergillosis is a mycosis causing the highest morbidmorbidity in captive birds. It is also the main respiratory disease observed on this group. A. fumigatus is the pathogen more commonly detected in clinical cases, mainly due to its high capacity of being environmentally disseminated and producing secondary metabolites, as well as due to its reduced propagule size. The mycosis treatment is inefficient mainly due to the limited availability of antifungal compounds, the high toxicity found on these compounds and the resistance of Aspergillus species. Thus, the aim of this work was to evaluate the therapeutic potential of OEO in both the treatment and prevention of experimental chronic aspergillosis, caused by A. fumigatus in poultry (Gallus gallus). Initial experiments were carried out to test the in vitro OEO-sensitivity of Aspergillus spp., oil toxicity, and the experimental progression of disease in poultry. In vitro sensitivity testes were carried out with A. fumigatus, A. flavus and A. niger, starting with a concentration of 900mg/mL (6%) OEO, going through ten serial dilutions (log2 scale). Systemic acute toxicity (24h of exposure) and systemic subchronic toxicity (30h of exposure) tests were carried out, with OEO concentrations of 225mg/mL (1.5%), 450mg/mL (3.0%) and 675mg/mL (4.5%). The experimental infection was accomplished in three stages, with diverse inoculation concentrations, volumes and frequencies being tested. Both in aspergillosis treatment and prevention, groups tested were either treated with OEO (O), with the standard anti-fungal itraconazol (I), with both products combined (I+O), or with none of them (C). Fifteen different active compounds were observed in the chemical analysis of the oil, being 4- terpineol (18.4%), sabinene hydrate (15.6%) and thymol (13.6%) the major components found. At the in vitro sensitivity test, the essential oil displayed both fungicide and fungistatic effect towards Aspergillus spp., with MIC varying between 28.125mg/mL (0.1875%) and 450mg/mL (3%) and MFC varying between 112.5mg/mL (0.75%) and 450mg/mL (3%). In all concentrations tested, the essential oil from O. vulgare did not cause any clinical or anatomopathologic alteration. Experimental reproduction of chronic A. fumigatus aspergillosis in 15 day-old poultry was achieved by using an inoculum concentration of 12x108 Colonies Forming Units/mL (CFU) in three serial inoculations at 24h intervals, being day three considered the first day of infection. The use of OEO in aspergillosis treatment and prevention was best observed in I+O, resulting in less clinical, anatomopathologic and microscopic signs, as well as a smaller count of CFU/g/organ. Overall, I and O were less effective than I+O, but more effective than C. Nevertheless, it was not possible to evaluate which group increased the mycosis treatment and/or prevention efficacy.