Expressão gênica e taxas de desenvolvimento de embriões Mus musculus domesticus expostos à pressão gasosa no estágio de 8-células e submetidos à crioconservação no estágio de blastocisto.

Abstract

Os objetivos dos experimentos foram primeiro determinar as taxas de desenvolvimento in vitro de embriões murinos no estágio de 8-células expostos a 15.7 MPa de N2 durante 2 ou 4 horas. Segundo, determinar as taxas de sobrevivência embrionária à crioconservação dos blastocistos originados a partir do cultivo dos embriões de 8-células após a indução do estresse subletal celular com o auxílio da pressão gasosa. Terceiro, determinar a expressão dos genes BAX, Bcl2, GLUT1, GLUT3, IGF1, IGF2, IGF1-R, IGF2-R, SOD2, HSP70.1, AQP3 e PPIA nas seguintes etapas experimentais: no estágio de 8-células imediatamente após a coleta dos embriões; no estágio de blastocisto antes e após o congelamento. Nas seis replicações realizadas foram utilizados 14 machos e 60 fêmeas Mus musculus domesticus. Na primeira etapa dos experimentos, das fêmeas superovuladas, 38 produziram 1092 embriões viáveis no estágio de 8-células que foram, de forma aleatória, divididos em quatro grupos experimentais: Grupo P1 – os embriões foram expostos a 15.7 MPa de N2 gasoso durante 2 horas e após cultivados in vitro até alcançar o estádio de blastocisto; Grupo P2 – os embriões foram tratados de maneira idêntica aos do Grupo P1, sendo expostos aos 15.7 MPa de N2 gasoso durante 4 horas; Grupo controle CE - os embriões foram submetidos ao cultivo in vitro imediatamente após a coleta; Grupo controle CB: os embriões foram mantidos em temperatura ambiente (22 ºC) durante 4 horas e após colocados na estufa para o cultivo in vitro. Na segunda etapa, amostras dos embriões dos quatro grupos experimentais tiveram a expressão gênica determinada com auxílio da amplificação e determinação quantitativa do mRNA (“Real Time PCR”). Os resultados do desenvolvimento embrionário ao estágio de blastocisto na primeira etapa foram os seguintes: Grupo P1 – 96,4% (245/253); Grupo P2 – 94,0% (253/269); Grupo CE – 95,0% (249/262) e Grupo CB – 95,4 (249/261). Na segunda etapa dos experimentos os resultados de reexpansão dos blastocistos após a criopreservação foram: Grupo P1 – 86,3% (63/73); Grupo P2 – 80,0 (76/95); Grupo CE – 72,8 (67/92); Grupo CB – 83,6 (92/110). A análise da expressão da maioria dos genes não revelou diferenças entre os grupos experimentais, provavelmente devido à variação biológica dos embriões entre os grupos e dentro de um mesmo grupo. A exposição dos embriões no estágio de 8-células a 15.7 MPa de N2 gasoso não comprometeu a viabilidade in vitro para desenvolverem-se ao estágio de blastocisto. As taxas de sobrevivência dos blastocistos à criopreservação diferiram somente entre os grupos de embriões expostos à HGP durante 2 horas (P1) no estágio de 8-células (86,3%) e o grupo de embriões submetidos ao cultivo in vitro (CE) (72,8%). Os resultados dos experimentos revelaram que a HGP pode ser empregada na indução de estresse celular subletal em embriões murinos.

The first objective of the experiments was to determine the development rates of mouse embryos exposed to high gaseous pressure (HGP – 15.7 MPa gaseous N2) at 8-cell stage for 2 or 4 hours. Second, determine the blastocyst re-expansion rates after cryopreservation. Third, determine the relative expression of BAX, Bcl2, GLUT1, GLUT3, IGF1, IGF2, IGF1-R, IGF2-R, SOD2, HSP70.1, AQP3 and PPIA in the following experimental steps: immediately after collection of 8-cell stage embryos, at the blastocyst stage before and after freezing. Fourteen males and 60 females Mus musculus domesticus were used in six experiment replications. Thirty-eight (63%) from the 60 superovulated, females produced 1092 viable embryos. These 8-cell stage embryos were then randomly divided into four experimental groups: P1 group – embryos were first exposed to 15.7 MPa of gaseous N2 for 2 hours and after cultured in vitro until the blastocyst stage; P2 group - embryos were treated identically to the P1 group, but were exposed to 15.7 MPa of gaseous N2 for 4 hours; CE control group - embryos were submitted to in vitro culture immediately after collection; CB control group - embryos were maintained at room temperature (22ºC) for 4 hours and after cultured in vitro. The results of embryo in vitro development to the blastocyst stage were: P1 Group- 96.4% (245/253); P2 group- 94.0% (253/269); CE group- 95.0% (249/262) and CB- 95.4 (249/261). After cryopreservation the blastocyst re-expansion rates were: P1 group- 86.3 % (63/73); P2 group- 80.0 (76/95); CE group – 72.8 (67/92), CB group- 83.6 (92/110). No major differences in gene expression were observed among treatment groups for most genes analyzed in this study, likely due to the biological variability in groups of embryos within each group. Exposure of embryos at 8-cells stage to 15.7 MPa of gaseous N2 did not compromise in vitro embryo viability to reach the blastocyst stage. The survival rates of blastocysts to cryopreservation differ only among the embryos that were exposed to the HGP during 2 hours at 8-cell stage (86,3 %) and the 8-cell stage embryos that were submitted to the in vitro culture immediately after collection (72,8 %). The experimental results showed that HGP can be used to induce sublethal cell stress in murine embryos.