Lectina dos rizomas de Arundo Donax L.: purificação,caracterização, propriedades,imuno-histoquímica e separação das isoformas

Abstract

Algumas características como a falta de cristais de oxalato de cálcio, de estruturas secretoras e de tricomas, e a riqueza de fibras constituíndo estratos localizados imediatamente abaixo da epiderme e limitando o parênquima cortical, e formando bainhas vasculares, subsidia a autenticidade dos rizomas de Arundo donax. Além disto, os rizomas contem amido, cumarinas, alcalóides, flavonóides e saponinas não hemolíticas. Uma lectina (ADL) especifica para GlcNAc e seus derivados oligossacarídeos foi isolada e purificada dos rizomas de Arundo donax L. (Poaceae) por cromatografia de afinidade em matriz de estroma de coelhopoliacrilamida, resultando em uma purificação de 12,15 vezes, rendimento de 6,58% e recuperação de 80 % da atividade hemaglutinante. A lectina purificada é heterotrimérica com massa molecular aproximada de 32.900 estimada por gel de filtração e de 33.000 obtida por SDS-PAGE, em condições não desnaturantes e não redutoras. A lectina purificada possui elevado conteúdo de Glu/Gln, Asp/Asn, Gly e Cys, mas não é glicosilada. ADL é relativamente estável ao calor e ao pH, e resistente à digestão por enzimas proteolíticas. Ela aglutina eritrócitos nativos de coelho, porco e em menor intensidade de rato e humanos A, B, AB e sua atividade hemaglutinante independe de cátions divalentes, mas é diminuída por agentes desnaturantes e redutores. A lectina de Arundo donax L. tem efeito citotóxico para células transformadas da linhagem HT-29, efeito inseticida para Dysdercus peruvianus e nematicida para Meloidogyne incognita. A ADL causou decréscimo na germinabilidade e retardo na germinabilidade dos diásporos de Lactuca sativa L. e também apresentou significativo efeito mitogênico e quimiotáxico. A ADL produziu sinais de toxicidade por via intraperitoneal em camundongos na dose de 300 mg/Kg e com a dose de 800 mg/Kg, 100 % dos camundongos foram a óbito, após 30 horas de sua administração. Sete isoformas da ADL foram separadas por PAGE preparativa. Das seis estudadas todas são heterotriméricas com massas moleculares relativas de suas cadeias polipeptídicas de aproximadamente 8,5, 18,9 e 13,1 kDa, totalizando 40,6 kDa. As isoformas demostraram ser estáveis face a vários fatores químicos e físico-químicos como a ADL, mas apresentaram desiguais intensidades na aglutinação de eritrócitos e inibição por carboidratos. A isoforma ADL-III é rica em resíduos de Glu/Gln, Gly, Asp/Asn e ainda Cys e as cadeias a e b possuem resíduos de triptofano na porção N-terminal. A ADL-III apresentou atividade mitogênica significativa. A ADL foi capaz de ligar-se in vitro a células transformadas das linhagens T-47D, HT-29 e T-24. Por técnicas imunohistoquímicas, a ADL foi detectada na parede celular das fibras e em algumas poucas células do parênquima cortical do rizoma.

Some characteristics like absence of calcium oxalate crystals, secretory structures and trychomes and the richness of fibers that form strata localized immediately under the epiderms and limiting the cortical parenchyma or forming bundle sheaths, subsidize the authenticity of these rhizomes. Besides the rhizomes contain amide, coumarins, alkaloids, flavonoids and nonhemolytic saponins. A lectin (ADL) specific to GlcNac and its oligosaccharides was isolated and purified from Arundo donax L. (Poaceae) rhizomes by affinity chromatography on rabbit stroma-polyacrilamide column. The lectin was purified 12.15 times, the yield of proteins was 6.58 % and the recovery of the hemagglutinating activity was 80 %. The purified lectin is heterotrimeric and has a molecular mass of 32,900 approximately estimated by gel filtration and of 33,000 by SDS-PAGE in non denaturating and non reducing conditions. The purified lectin is rich in Glu/Gln, Asp/Asn, Gly and Cys, but it is not glycosilated. ADL is relatively heat- and pHstable and it is resistent to disgestion by proteolytic enzymes. It agglutinates native rabbit, pig erythrocytes and with lower intensity rat and human A, B and AB erythrocytes, and its hemagglutinating activity is independent of divalent cations, but it is decreased by denaturating and reducing agents. Arundo donax L. lectin displays cytotoxic effect on Dysdercus peruvianus and nematicide activity againt Meloidogyne incognita. ADL decreases the germinability and delays the mean time for germinability of Lactuca sativa L. diasphores and also shows significant mitogenic and chemotactic effect. The lectin induce toxicity signals in mice by intraperitoneal injection with the dose of 300 mg/kg and 800 mg/kg caused 100 % death of the animals, 30 h after its administration. Seven isoforms of ADL were separated by preparative PAGE. The six isoforms studied are heterotrimeric, with polypeptide chains of molecular mass of 8.5, 13.1 and 18.9 kDa determined by mass spectroscophy and with 40.6 kDa of lectin molecular mass. The isoforms showed stability when subjected to the action of distinct chemical and physico-chemical factors as ADL showed. However, they exibited unequal intensity of erythrocyte agglutination and carbohydrate inhibition. ADL-III is rich in Glu/Gln, Gly and Asp/Asn and Cys residues, and its Nterminal a and b chains contain tryptophan residues. ADL-III showed significant mitogenic activity. ADL was able to bind to transformed cells from T-47D, HT-29 and T-24 lines in vitro. Immunohistochemical techniques allowed to localize ADL in the fiber cell walls and in some few cortical parenchyma cells of the rhizome.