Queratinases de BACILLUS subtilis S14 : produção, expressão e análise de enzimas mutantes

Abstract

Enzimas industriais movimentam um mercado mundial estimado em sete bilhões de dólares anualmente. Entre essas enzimas, incluem-se as queratinases, enzimas capazes de catalisar a hidrólise de queratina e com aplicação potencial na indústria coureira. A queratinase KerS14, produzida pelo Bacillus subtilis S14 é capaz de depilar o couro sem causar danos ao colágeno. Embora tenha esta capacidade de grande interesse biotecnológico, sua baixa termoestabilidade a 50 °C é uma característica desvantajosa para a aplicação industrial da enzima. Visando aumentar a produção de queratinases pelo B. subtilis S14 e a termoestabilidade da KerS14, duas estratégias foram adotadas: mudanças nas condições de cultura do microrganismo selvagem e obtenção de enzimas mutantes recombinantes. Na primeira estratégia, B. subtilis S14 foi cultivado em meio farinha de pena 1,5% e CaCl2 1%. O sobrenadante da cultura foi caracterizado e 60% da atividade queratinolítica permaneceu depois de armazenada por nove dias a temperatura de 50 °C. Em paralelo, a ORF que codifica a KerS14 foi amplificada e clonada em vetor de expressão. Os resíduos de aminoácidos G61, S98 e P239 da KerS14 foram modificados por mutagênese sítio dirigida , as enzimas mutantes foram expressas in Escherichia coli e purificadas. A enzima recombinante (rKerS14) foi mais termoestável do que a enzima selvagem. Além disso, foi verificado que o fibrinogênio e fibrina são hidrolisados pela rKerS14, mostrando que a enzima também tem potencial para desenvolver drogas para o tratamento de doenças cardiovasculares.

Industrial enzymes have a world market of more than seven billion dollars per year. Keratinases are among these enzymes. They have a potential for use in tannery. The keratinase KerS14, produced by Bacillus subtilis S14, differ from other keratinases because it can depilate leather without damaging collagen. Despite this great biotechnological potential, its low thermal stability at 50 °C is an undesirable property for industrial application. In order to increase keratinases production by B. subtilis S14 and KerS14 thermal stability, two strategies were adopted: changes in wild–type microorganism growth conditions and producing recombinant mutant enzymes. In first strategy, B. subtilis S14 were grown in feather meal 1.5% and CaCl2 1 %. The supernatant obtained after fermentation was characterized and its keratinolytic activity remained in 60% after nine days of storage at 50 °C. In parallel, the KerS14 ORF was amplified and cloned into an expression vector. The KerS14 amino acid residues G61, S98 and P239 were modified and mutant enzymes were expressed in Escherichia coli and purified. It was verified that recombinant enzyme (rKerS14) is more thermal stable than the wild–type enzyme. In addition, it is able to hydrolyze fibrinogen and fibrin which is useful to develop drugs for the treatment of cardiovascular diseases.