Lipases de Metarhizium anisopliae : purificação parcial, regulação e secreção durante o processo de infecção do carrapato bovino Boophilus microplus

Abstract

Lipases (triacilglicerol acilhidrolases, EC 3.1.1.3) são serino hidrolases de considerável relevância fisiológica e potencial uso industrial. O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é um dos mais importantes e bem estudados agente biológico para o controle de muitos artrópodes-praga incluindo o carrapato bovino Boophilus microplus. Lipases secretadas por M. anisopliae podem estar potencialmente envolvidas no processo de infecção do hospedeiro, porém, estudos sobre estas enzimas vêm sendo negligenciados em fungos. Neste trabalho, desenvolvemos uma estratégia simples objetivando detectar e quantificar a atividade de lipase durante a infecção de B. microplus por M. anisopliae. Além disso, estudamos os efeitos de diferentes fontes de carbono, incluindo componentes do tegumento do hospedeiro, na secreção de lipases por M. anisopliae em sobrenadantes de cultura. Apresentamos, também, a purificação parcial de uma lipase secretada em cultura líquida de M. anisopliae. A atividade de lipase aumentou de 0,03 U para 0,207 ± 0,021 U e de 0,033 ± 0,002 U para 0,358 ± 0,05 U durante a infecção (6 a 96 horas) em carrapatos vivos e mortos, respectivamente, infectados por M. anisopliae. Em culturas líquidas observamos altos níveis de atividade lipolítica principalmente em culturas suplementadas com quitina mais lipídeo animal. Nos zimogramas a atividade de lipase foi detectada em carrapatos infectados mortos e vivos em todos tempos testados como também em todos sobrenadantes de cultura analisados. A purificação parcial foi realizada com dois passos cromatográficos incluindo uma cromatografia de troca aniônica que apresentou somente um pico de atividade no gradiente salino. Esperamos que os resultados apresentados neste trabalho contribuam para elucidar a função desempenhada pelas lipases no processo de infecção do hospedeiro de M. anisopliae.

Lipases (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) are serine hydrolases of considerable physiological significance and industrial potential. The filamentous fungus Metarhizium anisopliae is one of the most important and best-studied biological agent for control of many arthropod pests including the cattle tick Boophilus microplus. Lipases secreted by M. anisopliae could potentially be involved in the host infection process but studies about these enzymes have been neglected mainly in fungi. In this work, we developed a simple strategy aiming to detect and quantify lipase activity during B. microplus infection by M. anisopliae. Moreover, we studied the effects of different carbon sources, including components of the tegument of host, on lipase secretion by M. anisopliae in culture supernatants. We presented, also, a partial purification of secreted lipolytic enzyme in M. anisopliae liquid culture. Lipase activity increases from 0.03 ± 0 U to 0.207 ± 0.021 U and from 0.033 ± 0.002 U to 0.358 ± 0.05 U during infection (6 to 96 hours) in live and dead ticks, respectively, infected by M. anisopliae. In liquid cultures we observed high levels of lipolytic activity mainly in cultures supplemented of chitin plus animal lipid. In zymograms, lipase activity was detected in infected dead and live ticks in all times tested as well as in all analyzed liquid culture supernatants. A partial purification was achieved with two chromatographic steps including an anionic exchange chromatography that presents only one peak of lipase activity in the saline gradient. We hope that results presented in this work contributes to elucidate the role played by lipases in M. anisopliae host infection process.